外泌体表达蛋白在阿尔茨海默病诊断中的应用_阿尔茨海默病

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是导致老年人痴呆的常见病因，随着社会人口的老龄化，已成为全球重要的健康问题之一。目前我国65岁以上老年人中AD的患病率为3.21%[1]，约近600万患者，给家庭和社会带来了沉重的照顾负担和经济负担。AD是一种神经系统退行性疾病，其发病机制复杂，目前普遍认可的特征性病理改变是在神经细胞外的β淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）聚集形成的老年斑和神经细胞内过度磷酸化的tau蛋白聚集形成的神经原纤维缠结。通过检测脑脊液中Aβ和tau的表达水平或正电子发射断层成像（positron emission tomography，PET）上Aβ在大脑的沉积，很大程度地提高了AD诊断的准确性，并被纳入诊断标准和研究框架。然而，由于腰椎穿刺的有创性和PET对设备要求高、价格昂贵等局限性，限制了其在临床工作中的广泛开展。随着对AD发病机制了解的不断深入和检测技术的革新，已从外周体液中发现了一些可能与AD发病相关的生物标志物，而其临床实践的突破有赖于探寻能直接反映中枢神经系统病理生理改变的分子途径。

外泌体是直径小于150 nm的囊泡样结构，20世纪70年代由Johnstone和Stahl首次描述，早期被认为是细胞的"排泄物"，并没有引起重视。直到近来几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为载体传递给其他细胞，从而改变受体细胞的功能，才开始逐渐受到关注。这些细胞特异性的蛋白和核酸，很可能反映出疾病的发病机制和病理生理过程中细胞内变化的核心因素。由于外泌体可以穿过血脑屏障，外周循环中神经系统来源的外泌体（neuronal derived-exosomes，NDEs）表达相关蛋白有可能成为中枢神经系统疾病的潜在生物标志物。

外泌体在AD发病机制中的作用

外泌体作为致病蛋白的运送者，参与多种突变或错误折叠的"毒性"蛋白的传播。这种现象已在包括AD、帕金森病、朊蛋白病、多发性硬化、脑肿瘤和精神分裂症等多种神经系统疾病和精神疾病的研究中得到证实。外泌体参与AD病理过程于2002年被首次报道，之后的大量研究证实其在AD的发病机制中具有多重作用。

淀粉样蛋白前体（amyloid precursor，APP）被β位点APP切割酶1切割，主要发生在早期核内体，之后产生的Aβ和其他的蛋白切割产物一起被转运到MVBs，进而进入外泌体中。研究表明，app和Aβ在MVBs中都有聚集，并且通过外泌体释放到细胞外。对猕猴大脑切片的研究发现，AD病理改变早期内吞作用受损，诱导早期核内体中神经节苷脂（gangliosides，GM1）与Aβ紧密结合，进一步引起淀粉样纤维的形成。散发型AD患者的大脑中也发现神经元内吞途径的损伤，例如早期核内体的增大和核内体中对于物质运输起重要作用的Rab5蛋白的上调，这些损伤显着加速了GM1相关外泌体的释放，并诱导了淀粉样纤维的形成。此外，研究发现Aβ多肽可以激活中性鞘磷脂酶2，诱导与Aβ接触的星形胶质细胞中前列腺细胞凋亡因子-4和神经酰胺分泌增多，富含两种促凋亡因子的外泌体分泌也增多，这些外泌体可以被未接触Aβ多肽的星形胶质细胞捕获进而引起细胞凋亡。而通过抑制外泌体的分泌，可以观察到AD小鼠模型大脑中淀粉样斑块较前减少。

外泌体也可以介导tau蛋白的扩散和传播，病理性tau蛋白的摄取导致受体细胞中单个tau蛋白的错误折叠和聚集。对神经母细胞瘤M1C细胞诱导的tau病理模型的研究发现，外泌体可以介导tau蛋白的输出。在tau病理小鼠模型中观察到外泌体参与了tau蛋白的转运，通过耗竭小胶质细胞或抑制其外泌体合成的方式均可减少tau蛋白的传播。

也有研究发现外泌体在AD的病理过程中起到保护作用。例如，富含鞘糖脂的神经源性外泌体可以摄取Aβ，同时促进小胶质细胞捕获Aβ，进而减少了app转基因小鼠大脑中的Aβ沉积。另外，外泌体中高表达的细胞朊蛋白可以通过N端与Aβ高亲和力结合，加速其纤维化，进而减少了Aβ寡聚体的神经毒性作用。由此可见，外泌体密切参与了AD的病理生理过程，然而在不同的发病时期可能对AD病理发挥着不同的，甚至是相反的作用。

神经源性外泌体表达蛋白对AD的诊断价值

Goetzl和Kapogiannis团队首先利用化学吸附的方法提取血浆中总的外泌体，再使用抗人神经细胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）抗体或者抗人CD171 [L1细胞黏附分子（L1 cell adhesion molecule，L1CAM）]抗体，利用免疫沉淀的方法进一步提取NDEs，并采用酶联免疫吸附试验检测了NDEs的AD相关蛋白水平。初的研究主要集中在Aβ和tau蛋白，其中Aβ42、P-T181-tau和P-S396-tau水平在AD患者均高于正常对照。纵向研究进一步发现，这3个指标在AD的临床前期和前驱期已明显升高，而总tau的表达并无显着差异。随后，通过此方法又陆续检测了一些可能参与AD病理过程的蛋白在NDEs中的表达，例如：（1）突触病理相关：突触结合蛋白、突触足蛋白、突触小泡蛋白、神经颗粒素（neurogranin，NRGN）等；（2）糖代谢减低/胰岛素抵抗相关：异常磷酸化胰岛素受体底物1（P-S312-IRS-1和P-panY-IRS-1）；（3）神经退行性变相关及其他生物标志物：溶酶体蛋白[Cathepsin D、溶酶体相关膜蛋白1（lysosome-associated membrane protein 1，LAMP1）等][30]和抑制元素1-沉默转录因子（repressor element 1 silencing transcription factor，REST）[26，31]。在上述已检测的相关蛋白中，P-S312-IRS-1、P-panY-IRS-1、Cathepsin D、LAMP1、Ubiquitin、LRP6、HSP1、REST、HSP70、NRGN、突触结合蛋白、突触足蛋白、突触小泡蛋白和突触蛋白1等在AD患者和正常对照有明显差异，其中大部分相关蛋白在痴呆症状出现前就已存在改变。此外，突触病理相关蛋白与AD患者的认知功能和病情严重程度具有相关性。我国新近的多中心研究进一步证实外周血NDEs与脑脊液的Aβ42、T-tau和P-T181-tau表达水平具有高度相关性。

纵观目前对外周NDEs表达蛋白检测的研究，尚存在一些方法和技术上的问题待解决。首先，在外泌体的研究中，不可避免地会存在来自其他细胞外囊泡亚群的干扰。之前的研究大多应用免疫沉淀的方法（如L1CAM抗体）提取NDEs，但严格讲L1CAM并不是中枢神经系统特异的，在其他组织（例如脂肪和骨骼肌）也有表达[33]。另外，生物流体中还存在包括蛋白复合物、脂蛋白（高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和乳糜微滴）和微生物等可能对实验过程构成影响的干扰物。其次，目前对生物标志物的计数是比较粗略的，大多先要通过CD81的表达水平将NDEs含量进行标准化。但CD81并不是外泌体相对特异的标志物，其他的细胞囊泡结构也有表达。Alix可能在外泌体计数和标准化方面是一个重复性较好的标志物[35]。此外，样本采集和保存过程中的诸多因素，也可能对外泌体的提取和检测构成未知的影响。制定标准化的外泌体提取和分析操作流程，将是今后外泌体作为AD等神经系统退行性疾病生物标志物应用研究的重要环节。

目前的研究表明外泌体在AD的发病中有多重作用。一方面，外泌体可在细胞间传播毒性的Aβ和tau，并可能会诱导星形胶质细胞的凋亡；另一方面，由于小胶质细胞对外泌体的摄取，可以减少大脑Aβ的负荷和毒性作用。尽管外泌体在AD病理生理过程中的具体作用还需要深入探索，但前期的初步研究已发现通过对外泌体表达分子的检测可以有效早期识别AD，并预测轻度认知障碍向AD的转化。未来，通过对检测技术的精准化和标准化，开展与病理改变或脑脊液、PET等"金标准"的生物标志物比较的前瞻性研究，将进一步推进外周外泌体检测在AD早期诊断和病情监测中的应用。