中国医学科学院/中山大学发现非小细胞肺癌生物标志物

近日，中国医学科学院周光飚、王艳及中山大学张力共同在国际期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》在线发表题为“Nuclear AhR and membranous PD-L1 in predicting response of non-small cell lung cancer to PD-1 blockade”的研究论文，该研究发现核AhR和膜性PD-L1可以预测非小细胞肺癌对PD-1阻断的反应情况。

研究背景

程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)已被用作免疫检查点抑制剂(ICI)的生物标志物，在非小细胞肺癌(NSCLC)中发挥持久疗效。然而，许多PD-L1高表达患者仅对ICI有轻微缓解，而PD-L1低表达患者仍可从ICI获益。转录因子芳香烃受体(AhR)在固有免疫细胞和适应性免疫细胞的发育和功能中发挥重要作用，控制肺上皮细胞中PD-L1的表达，并与患者对ICI的应答相关。在这里，研究人员测试了AhR和AhR核转位蛋白(ARNT)是否可以增强PD-L1在NSCLC ICI治疗中的预后预测价值。

研究过程

在2016年7月至2018年11月期间，研究人员获得了65例非小细胞肺癌患者的ICI治疗前福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)标本，这些患者随后接受了派姆单抗治疗。在该训练队列中，采用多重免疫组化(mIHC)方法评估核定位AhR (AhRN)、细胞质AhR (AhRC)、核定位ARNT (ARNTN)、膜定位PD-L1 (PD-L1M)和核定位PD-L1N多重阳性染色的细胞比例。根据患者的无进展生存期(PFS)确定PD-L1M、AhRN、AhRNARNTN、AhRNPD-L1M、AhRC、PD-L1N、ARNTN、AhRNPD-L1N、AhRcPD-L1N、、AhRCARNTN、ARNTNPD-L1M、ARNTNPD-L1N的较佳密度临界值。高比例的PD-L1M+细胞对免疫治疗反应较好。值得注意的是，AhRN 、AhRNARNTN 和AhRNPD-L1M 的密度可有效预测患者的PFS。考虑到有效区分应答者的能力，研究人员选择PD-L1M、AhRNPD-L1M、AhRNARNTN、AhRN、PD-L1N、ARNTNPD-L1N和AhRCPD-L1N进行进一步的模型构建。风险评分图提示AhRNPD-L1M、AhRNARNTN、PD-L1M为预后有利因素，ARNTNPD-L1N、AhRCPD-L1N为预后不利因素。

研究人员在确认应答者中集中有AhRNPD-L1M-、AhRNARNTN-和PDL1M阳性细胞后，选择这3个因子进行进一步比较。将三个队列合并检验这些因素的预测能力，结果表明，与AhRNARNTN (AUC: 0.764;95% CI: 0.692-0.837)和PD-L1M (AUC: 0.702;95% CI: 0.624-0.78)， AhRNPD-L1M的AUC较大(0.857;95% ci: 0.799-0.915）， Delong检验证实AhRNPD-L1M是准确的预测因子(Z = 3.116, P = 0.00183)。AhRNPD-L1M在预测PFS和OS、短期和长期观察以及绝大多数情况下根据临床病理因素分层具有较高的准确性。多变量Cox回归分析显示，AhRNPD-L1M和PD-L1M是PD-1阻断后非小细胞肺癌的独立预后指标，且AhRNPD-L1M作用更强。

核 AhR 和膜 PD-L1 预测非小细胞肺癌对 PD-1 阻断的反应

为了验证 mIHC 的发现，研究人员通过蛋白质印迹检测了 AhR 和 PD-L1 的表达。在 15 名具有足够冷冻肿瘤样本的患者中，在细胞核和细胞质区室中检测到 AhR，而在细胞膜、细胞质和细胞核中检测到 PD-L1，并且 AhR的表达水平更高，患者从免疫治疗中获益的可能性越大（P = 0.012）。

研究人员建立了异种移植小鼠模型以验证患者样本的发现，发现注射小鼠肺癌 LLC 和结肠癌 MC38 细胞的小鼠肿瘤组织表现出高水平的 AhRN，而注射小鼠纤维肉瘤 Ag104Ld 细胞的小鼠具有低水平的AhRN。

为了进一步剖析潜在机制，研究人员从the Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库中下载了255例肺腺癌和251例肺鳞状细胞癌样本的RNA-seq数据，并将其分为AhR高组和AhR低组，以中位表达水平作为截断值。我们发现AhR高组样本的免疫评分高于AhR低组样本。利用提供全面免疫基因组分析结果的癌症免疫组数据库(Cancer Immunome Database, TCIA)，研究人员发现AhR高组患者更有可能从CTLA-4、PD-1/PD-L1/PD-L2抑制剂中获益。之前发现，在暴露于烟草致癌物苯并(a)芘(BaP)的细胞中，AhR可以结合PD-L1启动子。在缺乏BaP的情况下，AhR过表达增加，而AhR抑制抑制了PD-L1启动子驱动的荧光素酶活性。通过染色质免疫沉淀(ChIP)和实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，研究人员发现AhR直接结合PD-L1的启动子在其转录起始大小的上游- 700至- 100 bp，证实了AhR能够控制PD-L1的转录。

研究意义

综上所述，AhR在调节PD-L1表达和免疫细胞浸润中的作用可能有助于其预测非小细胞肺癌对ICIs的反应。AhRN PD-L1M是一种准确、简单、廉价的非小细胞肺癌免疫治疗生物标志物。