重大发现！北京大学团队发现抑制结肠癌新靶点

在本研究中，lncRNA miR663AHG的亚细胞定位是通过RNA-FISH来确定的。采用qRT-PCR检测miR663AHG和miR663a。体外和体内研究miR663AHG对结肠癌细胞生长和转移的影响。利用CRISPR/Cas9、RNA pulldown等生物学检测方法探索miR663AHG的潜在机制。我们发现miR663AHG主要分布在Caco2和HCT116细胞的细胞核以及SW480细胞的细胞质中。

119例患者结肠癌组织中miR663AHG的表达水平与miR663a的表达水平呈正相关(r = 0.179, P = 0.015)，与配对的正常组织相比，miR663AHG的表达水平显著下调(P < 0.008)。miR663AHG低表达的结肠癌与pTNM晚期(P = 0.021)、淋巴转移(P = 0.041)和较短的总生存期相关(风险比= 2.026;p = 0.021)。实验表明，miR663AHG抑制结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。过表达miR663AHG的RKO细胞移植物在BALB/c裸鼠体内的生长速度慢于载体对照细胞(P = 0.007)。有趣的是，无论是rna干扰还是白藜芦醇诱导miR663AHG或miR663a的表达变化，都可以触发miR663AHG基因转录的负反馈调控。在机制上，miR663AHG可以结合miR663a及其前体pre-miR663a，阻止miR663a靶mrna的降解。通过敲除MIR663AHG启动子、外显子1和pri- miR663a编码序列来破坏负反馈，完全阻断了MIR663AHG的这些作用，在转染miR663a表达载体的细胞中恢复了MIR663AHG的这些作用。综上所述，miR663AHG作为肿瘤抑制因子，通过与miR663a/pre-miR663a的顺式结合抑制结肠癌的发展。miR663AHG和miR663a表达之间的串扰可能在维持miR663AHG在结肠癌发展中的功能中起主导作用。

研究背景

结肠癌是世界上死亡率仅次于肺癌的恶性疾病。预计到2022年，美国将有近10万名新诊断的结肠癌患者，死亡率将达到约8.6%。虽然DNA甲基化标记筛查、结肠镜检查和结肠粘膜息肉切除术的普及在早期诊断和预防方面取得了长足进展，但50岁以下人群的结肠癌发病率仍在稳步上升。对其机制的深入研究可能会加快结肠癌发生机制的阐明。

随着高通量RNA测序(RNA-seq)技术的发展，人们发现从人类基因组中转录出大量的非编码RNA (ncRNA)分子。长链非编码rna (lncRNAs)可以调节染色质构象、基因转录、hnRNA剪接以及其他生物过程，如癌症的发生。许多lncrna在癌组织中的表达状态异常。一些因素直接影响癌细胞的增殖、凋亡、转移、血管生成、耐药和干细胞的干性。此外，ncrna具有组织特异性和肿瘤特异性表达模式，有望成为患者粪便、血清/血浆和组织样本中潜在的结直肠癌筛查、诊断和预后生物标志物。

MIR663AHG是一个罕见的人类特异性基因(Entrez gene: 284801)，位于20号染色体的着丝粒上。该基因的初级转录本(hnRNA)可以同时剪接成microRNA miR663a和lncRNA miR663AHG。我们之前报道过miR663a在结肠癌组织中表达下调，miR663a抑制结肠癌细胞的生长和转移。相关研究表明miR663AHG表达的变化与椎间盘退变(IDD)的发生有关。另一项研究发现，miR663AHG在银屑病组织中下调。根据基因型-组织表达计划(GTEx)项目数据库，miR663AHG在人类各种正常组织中普遍表达，并具有相对丰度。然而，miR663AHG的生物学功能此前未见报道。在本研究中，我们首次研究了miR663AHG在结肠癌发生中的作用及其分子机制。

研究结果

miR663AHG的表征及其亚细胞分布

与蛋白质编码基因相比，ncRNA基因的转录起始位点(transcription start sites, tss)更加多样化。MIR663AHG是一个多外显子基因。miR663a和miR663AHG是由相同的hnRNA拼接而成的。在PhyloCSF分析中，miR663AHG的值小于零，表明该lncRNA不编码蛋白质。

lncRNA miR663AHG的表征

整个患者队列中研究参与者的人口学特征

众所周知，基因转录受转录起始位点(tss)周围CpG岛甲基化状态的调控。一个CpG岛位于MIR663AHG TSS周围。根据CCLE DNA甲基化和RNA-seq数据库的挖掘结果，高甲基化水平细胞系的miR663AHG和miR663a水平显著低于中、低甲基化水平细胞系(P < 0.05)。这表明MIR663AHG基因的转录受DNA甲基化调控。

在真核细胞中，lncrna的功能与其亚细胞定位密切相关。为了表征miR663AHG在结肠癌细胞中的分布规律，我们采用qRT-PCR方法初步测定了miR663AHG在6种结肠癌细胞系中的基线表达状态。miR663AHG水平在Caco2或SW620细胞中高于HCT116或RKO细胞，在SW480和LoVo细胞中较低。同样，miR663a水平在SW620细胞中较高，在SW480细胞中较低(数据未显示)。RNA-FISH分析结果显示，miR663AHG位于结肠癌细胞的细胞质和细胞核中，主要位于Caco2和HCT116细胞的细胞核中，以及SW480细胞的细胞质中。在LoVo细胞中未检测到miR663AHG杂交信号。

miR663AHG在体内外均抑制结肠癌细胞的生长和转移

为了研究miR663AHG的生物学功能，我们将miR663AHG基线表达水平较低的两株人结肠癌细胞株SW480和LoVo稳定转染miR663AHG慢病毒表达载体，而将miR663AHG基线表达水平较高的另外两株细胞株SW620和HCT116转染针对miR663AHG (si663AHG)的sirna。在长期动态观察分析中，miR663AHG过表达显著抑制SW480和LoVo细胞的增殖，而miR663AHG敲低则显著促进SW620和HCT116细胞的增殖。miR663AHG过表达和敲低也诱导了类似的集落形成率差异，这些结果在动物模型中得到了证实。稳定过表达miR663AHG的RKO细胞衍生的异种移植物生长明显慢于空对照细胞(P = 0.009)。

miR663AHG在结肠癌中的下调与预后不良相关

我们之前报道了miR663a在结肠癌组织(CCs)中的表达相对于患者匹配的手术边缘对照(SMs)显著下调。有足够RNA样本用于miR663AHG检测的患者(n = 119)被重新纳入本研究。qRT-PCR分析结果显示，与SMs相比，miR663AHG在cc中的表达显著下调，特别是在有淋巴转移或pTNM晚期或分化良好的cc中。

miR663AHG在不同临床病理特征患者结肠癌组织样本中的表达水平

Kaplan-Meier分析显示，miR663AHG低表达(低于中位数)结肠癌患者的总生存期(OS)显著短于miR663AHG高表达患者(P = 0.018)。单因素分析显示，4个危险因素与这些患者的OS显著相关。这些因素包括miR663 AHG低表达(风险比[HR]， 2.026;95%可信区间[CI]， 1.113-3.689)、pTNM分期、淋巴转移和远处转移。然而，在多变量分析中，只有转移状态与患者的OS显著相关，而miR663AHG水平与患者的OS无关。

此外，结合我们之前报道的miR663a数据，我们分析了这些结肠组织中miR663AHG和miR663a水平的相关性(n = 182;包括短信和短信)。两者呈正相关(r = 0.179, P = 0.015)，表明miR663a可能参与miR663AHG的生物学功能。此外，我们还使用公共微阵列数据集分析了相关性，发现353例卵巢癌样本之间存在类似的相关性(Spearman r = 0.168, P = 0.002)。

miR663AHG结合miR663a及其前体，保护miR663a靶标

为了探索miR663AHG在结肠癌发展中抑制作用的潜在潜在机制，我们使用StarBase v3.0数据库进行了生物信息学分析。我们发现miR663AHG可能直接顺式结合miR663a前体pre-miR663a(和pri-miR663a)。正如预期的那样，RNA下拉分析结果显示，生物素标记的miR663AHG确实与RKO细胞中的pre-miR663a(和pri-miR663a)结合，生物素标记的pre-miR663a也与miR663AHG结合。此外，生物素标记的miR663a在RKO细胞中也显著富集miR663AHG。这些结果证实了miR663AHG可以直接结合miR663a及其前体。

在机制上，我们发现miR663AHG(或miR663a)表达的改变，无论是通过表达载体还是抗氧化白藜芦醇处理诱导，都可以逆转内源性miR663a(或miR663AHG)表达的改变，表明miR663AHG基因表达存在负反馈回路。然而，miR663AHG和miR663a都是由相同的初级转录物拼接而成。miR663AHG和miR663a在人体组织中表达的上述正相关表明，miR663AHG基因的转录活性应该是决定miR663AHG和miR663a在人体细胞中表达水平的主导因素，尽管它们的确切表达水平和生物学功能是相互负相关的。

综上所述，我们的研究表明，lncRNA miR663AHG与miR663a及其前体pre-miR663a结合，诱导miR663a表达的负反馈。miR663AHG可能通过与miR663a及其前体的顺式结合，在宿主对炎症的防御反应和抑制结肠癌的发展中发挥重要作用。