新方法！前列腺癌精准新模型，可用于临床和药物开发

前列腺癌的体外研究依赖于已建立的细胞系，这些细胞系缺乏重要的生理特征，如适当的极化和相关生物标志物的表达。微生理系统(MPS)可以复制癌症微环境，并导致细胞表型变化，更好地代表体外器官生理。

在这项研究中，研究团队建立了一个由传统前列腺癌细胞组成的MPS模型，以评估其在动态培养条件下的活性。雄激素敏感细胞(LNCaP)和雄激素不敏感细胞(PC3)分别在常规和3D培养中培养，包括静态和动态培养。分析细胞形态、前列腺特异性抗原分泌、前列腺关键标志物及MicroRNA的表达情况。LNCaP在3D和MPS培养中形成球状体，细胞角蛋白和粘附蛋白的上调支持了形态变化。LNCaP在MPS中也保持恒定的前列腺特异性抗原分泌。PC3细胞在3D和MPS培养中没有形成复杂的结构。基因水平上的PSA表达在LNCaP-MPS中下调，在PC3-MPS中显著上调。细胞内和细胞外的三维静态和动态培养改变了MicroRNA表达。与前列腺癌进展相关的MicroRNA在LNCaP-MPS中大多上调。整体动态细胞培养实质上改变了LNCaP细胞的形态和表达，可以说是增加了它们的前列腺癌表型。这一新方法表明，前列腺癌细胞中的MicroRNA表达对外部刺激敏感，MPS可以有效促进常规前列腺癌模型中的重要生理变化。

研究背景

前列腺癌(PCa)是2018年男性肿瘤死亡的第二大恶性肿瘤和第五大原因。在世界范围内，前列腺癌的患病率和死亡率与年龄的增长有关，估计65岁以上的发病率为60%。前列腺癌细胞的生长和存活起初依赖于雄激素，即睾酮，其活性形式与雄激素受体(AR)结合，并调节参与细胞增殖或凋亡逃避机制的多种蛋白质的表达。雄激素剥夺疗法(ADT)是一种标准的、广泛使用的前列腺癌治疗方法。ADT积极下调睾酮的合成，从而抑制前列腺癌的增殖。大约10-15%的PCa患者出现去势抵抗，临床预后较差，中位生存时间为12-23个月。当恶性前列腺癌细胞在缺乏雄激素的情况下增殖，导致ADT无效时，去势抵抗性前列腺癌(CRPC)就会发生。CRPC的特征是连续三次分析中前列腺特异性抗原(PSA)增加，间隔至少一周，PSA水平> 2ng /ml或ADT后肿瘤放射学进展。

PSA是一种由前列腺上皮细胞产生的与钾化钾素相关的丝氨酸蛋白酶。它作为筛查、诊断和随访前列腺癌的生物标志物。生理上，PSA的分泌促进精子的活动，其表达受AR调控。这一生物标志物反映了前列腺细胞的增殖，PSA水平升高可提示癌细胞的存在。然而，尽管具有优势，PSA缺乏诊断特异性，不能指示疾病的严重程度或分期。良性前列腺疾病或损伤也可导致PSA水平升高。这说明需要更具体的PCa生物标志物作为诊断和预后工具。

MicroRNA (miR)已被确定为CRPC早期诊断的潜在生物标志物，有望在去势抵抗发生之前捕获这种恶性肿瘤。一些MicroRNA(如miR-4417, miR-3687, miR-205)已被描述在CRPC进展中具有功能作用。为了进一步探索MicroRNA在PCa和CRPC之间的分子转化中的作用，并验证其作为CRPC临床生物标志物的应用，需要临床和临床前的综合研究。

尽管在分子泌尿学研究中广泛使用和贡献了几种细胞系(例如AR去调控)，但由于各种PCa和CRPC细胞中生物标志物表达的高度可变性，它们在临床相关生物标志物的发现和验证以及作为临床前药物测试的强大平台方面的应用存在主要限制。此外，常规培养(2D)中的细胞系不能复制肿瘤微环境的异质性特征，不能维持上皮细胞的典型极性，并且关键细胞机制(如粘附蛋白、膜载体、代谢酶)的表达受到限制或缺失。

微生理系统(MPS)的进步使所谓的器官芯片得以引入，细胞在动态条件下培养。在MPS中，细胞暴露于不同的外部刺激(如流量、压力、机械应力等)，这些刺激促进了2D中缺失的特征的分化。近年来的研究表明，多磺酸粘多糖能显著改善上皮细胞的功能。在器官芯片模型中恢复的2D培养中一直缺失的显著特征是阴离子药物的分泌(肾脏)，肠道微生物组酶活性(肠道)和胆管形成(肝脏)。这些创新的体外平台正迅速被用于需要更好地代表人体生理学的毒理学和药学研究。近期试图证明动态培养对前列腺细胞行为的影响已经产生了有希望的结果。前列腺细胞可以在流体条件下保持活力。一项对雄激素敏感的LNCaP细胞的综合研究表明，MPS中的球体促进了细胞生长，改善了结构完整性，减少了坏死核心的形成，并下调了细胞应激基因的表达。流动培养的球状体对化疗的敏感性增加，并表现出更大的转录反应。

在本研究中，我们旨在建立前列腺癌- MPS (PCa- MPS)模型，在体外重建PCa和CRPC细胞的上皮性质以及它们的PSA和miRNA分泌。采用常用的LNCaP细胞作为雄激素敏感型PCa细胞的模型，PC3细胞作为雄激素不敏感型PCa细胞的模型。在MPS模型中探索这些细胞的潜力，为研究PCa生物标志物提供了一种新的、生理学上更准确的工具，可用于临床实践和药物开发应用。

研究结果

三维和MPS条件改变前列腺癌细胞的形态

在我们的研究中使用的MPS芯片使两个培养室之间的脉动流动在一个闭环中，这些刺激意味着培养基不断地在细胞上再灌注，ECM水凝胶在每个灌注周期中收缩。在3D(静态)和MPS培养中，LNCaP细胞生长成非空心球体，相对于传统培养，极化明显增加。在LNCaP球体中，表皮生长因子受体(EGFR)主要在细胞表面表达，而2D培养中，表皮生长因子受体分散在细胞质中。黏附蛋白ZO1的密度在MPS培养的细胞中也比在2D中更为明显，强调了球体的黏附增强。PC3细胞在MPS培养中未形成三维结构。尽管如此，EGFR的表达似乎集中在凝胶中单个细胞的周围。这表明，相对于EGFR分散在细胞质中的2D细胞，这些细胞的极性增强。在2D中，PC3细胞相互粘附，从细胞边界的ZO1表达可见一斑，这一特征在MPS培养中被排除在外。

HUMIMIC芯片2微生理系统

通过使用常规细胞系对PCa- MPS模型进行表征，我们展示了使用先进的体外系统研究PCa和CRPC细胞表型变化和MicroRNA分泌的潜力。MPS模型，如TissUse HUMIMIC芯片，受到低实验吞吐量的限制，然而，当用于解决特定的研究问题时，可以作为一个强大的工具。使用新一代测序(NGS)等方法来绘制非编码RNA的表达图谱已被证明可以大大增加基于MPS的实验的实验输出。这些方法可以从有限数量的样本中生成全面的数据集，从而较大限度地发挥复杂和劳动密集型微流体平台的效用。使用该系统的进一步研究可以研究PCa和CRPC细胞暴露于批准的治疗(如阿比特龙和恩杂鲁胺)期间和之后的MicroRNA分泌。随着时间的推移，MicroRNA分泌的改变可以通过诱导前列腺癌细胞的雄激素抵抗来实现。该模型在研究循环肿瘤细胞簇(CTC)作为前列腺癌(PCa)预后工具方面也具有优势。CTC与癌症转移有关，将患者活检获得的PCa组织外植体整合到微生理系统(MPS)中，有可能研究CTC的起源及其与PCa进展的相关性。在MPS中使用患者材料提供了额外的优势，因为它保留了PCa的异质性，并实现了事实上的离体培养。通过提供一个生理学上更相关的模型，PCa-MPS可以潜在地克服目前体外模型的局限性，尽管如此，需要全面的表征工作来了解动态培养中激素敏感和不敏感前列腺癌细胞的界限。