双管齐下增强疫苗效果，华人学者引领mRNA技术新突破

将mRNA作为疫苗潜力巨大，但其先天免疫原性高、易降解和体内递送效率低等问题，导致其在疫苗开发中进展不顺。随着 Drew Weissman 和 Katalin Karikó 提出的N1-甲基假尿苷（m1ψ）化学修饰，以及脂质纳米颗粒（LNP）递送载体的发明，为mRNA疫苗的开发扫除了上述障碍。

mRNA新冠疫苗的成功，让我们看到了这种基于mRNA技术的新型疫苗平台的强大威力。以mRNA新冠疫苗为例，编码了新冠病毒刺突蛋白（S蛋白）的经过化学修饰的mRNA被封装到了LNP中，以保护mRNA不会被快速降解，并帮助其进入细胞。一旦进入细胞中，其mRNA会被翻译表达刺突蛋白，被免疫系统检测到，从而产生中和抗体并激活T细胞免疫反应。如果此后感染新冠病毒，免疫系统会识别并迅速动员。

然而，化学修饰的mRNA的耐受性和翻译能力得到了提高，但也在很大程度上损害了先天免疫反应。因此，全世界各地的科学家们正在努力改进，尝试开发出更强大、能够产生更强的免疫反应的mRNA疫苗。

2023年9月6日，加拿大核酸疫苗与治疗研究主任（Canada Research Chair）、多伦多大学药学院助理教授李博文联合麻省理工学院教授 Robert Langer、Daniel Anderson在 Nature Biomedical Engineering 期刊发表了题为：Enhancing the immunogenicity of lipid-nanoparticle mRNA vaccines by adjuvanting the ionizable lipid and the mRNA（通过佐剂化可电离脂质和mRNA来增强LNP-mRNA疫苗的免疫原性）的研究论文【1】。

该研究同时对mRNA本身及其递送载体LNP进行工程化改造，一次通过双管齐下的方式开发出了“自佐剂化”mRNA疫苗，该疫苗通过注射接种或鼻内吸入式接种，均可大幅提高中和抗体滴度和T细胞应答。

如果进一步将其应用于人体，这类新型mRNA疫苗所需的剂量更低，从而有助于降低成本，并可能产生更持久的免疫力。该疫苗平台也可能有助于增强包括肿瘤疫苗在内的其他类型mRNA疫苗的免疫反应。

在这项发表于 Nature Biomedical Engineering 期刊的论文中，李博文等人希望进一步提高mRNA技术的潜力，增强mRNA疫苗的免疫反应。

佐剂（Adjuvant）是一种常用于增强疫苗免疫应答的分子，但尚未应用于mRNA疫苗。在这项研究中，研究团队对mRNA本身及其递送载体LNP同时进行工程改造，从而一次通过双管齐下的方式开发出“自佐剂性”的mRNA疫苗，让疫苗的内外成分同时发挥佐剂作用，从而增强mRNA疫苗的免疫反应。

首先，他们将目光聚焦在了C3d蛋白上，这是先天免疫系统的分支——补体系统的一部分，当补体系统被外源微生物激活时，补体中的C3d会附着到潜在抗原上，放大机体对这些抗原的产生的免疫反应。

在这种先天免疫机制的启发下，研究团队构建了编码抗原（新冠病毒S蛋白的RBD结合域）和三个C3d的融合蛋白的mRNA，这样一来，mRNA进入细胞后就能够表达出综合这两种功能的抗原-C3d融合蛋白。

李博文表示，在这项实验中，虽然添加C3d重复序列稍微降低了mRNA的蛋白表达量，但在相同的mRNA剂量下，生成的抗原-C3d融合蛋白的免疫激活能力却超过了原始抗原的10倍以上。重要的是，如果把抗原和C3d分开在两条独立的mRNA中表达，就不会产生这种显著的免疫增强效应。这一特异性意味着C3d不会盲目地增强其他抗原的免疫活性，从而确保了它应用于疫苗增强上的安全性。这个idea起初是受到自己研究生阶段阅读的一篇发表于1996年的 Science 论文的启发。该论文显示，含有两个和三个C3d的鸡蛋溶菌酶的免疫原性分别是单独鸡蛋溶菌酶的1000倍和10000倍，而单独游离的C3d对该抗原的免疫反应没有影响。mRNA技术让我们能容易就可以实现抗原与C3d的融合，迅速在mRNA框架内验证了这一论文的发现，并将C3d当做分子佐剂一次应用到mRNA疫苗里。

除了对mRNA分子层面的修改之外，研究团队还尝试优化用于递送mRNA疫苗的脂质纳米颗粒（LNP），从而让LNP除了递送mRNA外，还能发挥刺激免疫反应的作用。

纳米颗粒本身可能具有刺激免疫反应作用，但并不确定什么组分能够优化这种刺激作用。为了确定较有效的组分，研究团队构建了一个包含480种具有不同化学性质的可电离脂质文库，通过对这一文库进行高通量筛选和评估，从中发现了一些可能提高免疫反应的脂质。

接下来，研究团队在小鼠模型中测试了基于上述发现的新型mRNA疫苗，其mRNA编码了S蛋白和C3d融合蛋白，并使用了从文库中筛选鉴定到的性能较好的可电离脂质（lipid 331）组成的LNP递送载体。

与接种无佐剂的新冠mRNA疫苗的小鼠相比，接种这种新型mRNA疫苗的小鼠产生的中和抗体水平提高了10多倍，而且还产生了更强的T细胞反应。

今年6月份，宾夕法尼亚大学Michael J. Mitchell 教授团队（韩雪祥博士为第一作者）在 Nature Nanotechnology 期刊发表论文【2】，开发了一种新的LNP组分——佐剂类脂质，可以增强mRNA-LNP疫苗的佐剂性。

李博文表示，团队开发多重佐剂平台的目的是克服单一佐剂类脂质在剂量依赖性方面的局限，这一点在疫苗剂量较低时尤为明显。这并不难理解，因为更高的疫苗剂量会带来更多的佐剂类脂质以加强免疫激活，反之则效果有限。考虑到疫情初期mRNA疫苗的供应短缺，我们希望通过极低的剂量下也能实现优越或至少相似的疫苗效果，而单一佐剂方案无法实现这一目标。因此，我们构建了这个具有多重佐剂性能的疫苗平台，即使在非常低的剂量下，也能显著增强疫苗的免疫效应，实现“1+1>2”的综合效果。这种多重佐剂性mRNA-LNP疫苗设计不仅能通过降低剂量来减少成本和潜在的副作用，还在某些特定应用场景（如儿童疫苗或鼻腔疫苗）具有很高的价值。

针对呼吸道黏膜的鼻内疫苗可能解决肌肉内接种的不足。鼻内流感疫苗的临床前研究显示，黏膜免疫可以通过IgA抗体和组织驻留T记忆细胞增强对不同亚型流感病毒的保护，并提高抗病毒免疫力的持久性。此外，鼻内疫苗对儿童和有针头恐惧症的人更容易接受，也能规避针头和注射器或其他材料的短缺。尤其在大流行期间，使用鼻内疫苗对整个人群进行免疫将比肌肉内注射更快、更具成本效益。

李博文还提到，这项工作开始于新冠疫情初期，当时还不清楚mRNA疫苗是否可以进行鼻腔内接，因为其有效性可能会受到覆盖上呼吸道的黏液纤毛屏障的严重阻碍。

考虑到鼻腔疫苗的潜在优势，团队进一步探索了将这种新型RNA疫苗平台进行鼻腔内接种的可行性。当将该疫苗注入小鼠鼻腔后，他们在小鼠身上观察到了与注射注射接种类似的强烈免疫反应。如果该疫苗被开发用于人体，这种鼻内吸入式疫苗可能会提供更强的保护作用，因为它会在鼻腔和肺部的黏膜组织中产生免疫反应，在传染病毒进入血液循环之前就在黏膜处将其消灭。

论文通讯作者 Daniel Anderson 教授表示：如果你只是往鼻子里喷一些东西，而不是排队接种注射疫苗，那么鼻内疫苗可能也更容易让多人接种。

除了用于传染病疫苗外，mRNA技术的另一个重要应用是肿瘤疫苗，据悉，研究团队正在进行相应探索，还计划在大动物模型中测试这些新疫苗配方的有效性和安全性，希望终能在人类患者上进行测试。此外，这种mRNA疫苗能够在较低剂量下能引起更强的免疫反应，这也有助于减少接种所需的疫苗剂量，从而降低成本，帮助疫苗覆盖到更多的人群，特别是在中低收入国家和地区。

李博文表示，实验室正积极致力于将该疫苗增强平台应用于新抗原肿瘤疫苗的研发。众所周知，由于肿瘤引发的免疫抑制现象，癌症疫苗的研发难度相对传染病疫苗来说更大， Curevac公司的CEO Ingmar Hoerr 在其前列腺癌mRNA疫苗进入第二期临床试验失败后指出：What we’ve learned here is that mRNA is not enough on its own — you have to break tolerance and you have to make it more immunogenic （我们从这里学到的是，单纯的mRNA是不够的——你需要打破免疫耐受，并增强其免疫原性）。如何在保证安全性的前提下有效地打破免疫抑制，增强癌症疫苗引起特异性免疫反应一直是研究界的关注焦点。

博士后研究期间，李博文师从LNP技术先驱、麻省理工学院教授 Robert Langer（Moderna联合创始人）和 Daniel Anderson（Orna Therapeutics联合创始人），在此期间，他开发了能够高通量合成和筛选用于mRNA递送的可电离脂质组合文库，在此基础上发现了一系列新型LNP，可将mRNA递送到包括肝脏、脾脏和肺部等器官中，还可将Cas9/sgRNA-mRNA递送到肺上皮细胞、免疫细胞以及肝脏细胞中，实现长期的基因编辑。此外，他还开发了一系列具有双重功能的LNP，不仅能够递送mRNA，还可以作为佐剂来增强免疫反应。这些工作可应用于更好地帮助人类对抗传染病、癌症、自身免疫疾病，以及罕见遗传疾病。

2022年2月，李博文加入了多伦多大学药学院，任助理教授，并出任加拿大核酸疫苗与治疗研究主任（Canada Research Chair），他的实验室致力于开发新型、安全有效的核酸递送平台，开发基于核酸的新型疫苗和治疗方法，用于包括疫苗接种、免疫治疗和再生医学在内的一系列人类健康应用。

众所周知，LNP会向肝脏富集，因此，如何实现肝外靶向，是将mRNA技术应用于肝脏以外疾病治疗中的一大挑战。

今年3月份，李博文、Robert Langer、Daniel Anderson 等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Combinatorial design of nanoparticles for pulmonary mRNA delivery and genome editing（用于肺部mRNA递送和基因组编辑的纳米颗粒的组合设计）的研究论文【3】。

该研究利用构建的可电离脂质组合文库，筛选并鉴定了吸入式递送载体——RCB-4-8 LNP，这种领先的LNP具有更好的生物可降解性和安全性，可重复气管内给药。它提供了全球一个成功利用LNP实现高效肺上皮细胞基因编辑的方法，为先天性肺部疾病的基因治疗开辟了新的途径。

该研究实现了LNP对对肺部的靶向，通过吸入式递送，成功在小鼠肺部细胞进行CRISPR基因编辑，这为开发有效治疗肺部疾病的基因编辑药物奠定了基础。