施剑林院士团队发文：揭示肺癌联合免疫治疗创新策略

11月11日，中国科学院上海硅酸盐研究所施剑林院士团队在期刊《Nature Communications》上在线发表题为“Nanomedicine-based co-delivery of a calcium channel inhibitor and a small molecule targeting CD47 for lung cancer immunotherapy”的研究论文，本研究提出了一种针对原位肺肿瘤的联合免疫治疗策略，该策略通过建立基于亚微米层状双氢氧化物（LDH）的双小分子药物共递送系统，激活肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的抗肿瘤效应，诱导树突状细胞成熟，并通过树突状细胞的抗原呈递功能激活T细胞的抗肿瘤免疫反应。在肺癌模型中，这种联合方法呈现出抗肿瘤效应，并对肿瘤再曝露产生免疫反应，突显了其在肺癌免疫治疗中的潜力。

研究背景

根据国际癌症研究机构新统计数据，肺癌发病率排名第二，是全球癌症相关死亡的主要原因之一，每年有210万例新的肺癌病例和180万人死亡。在过去的十年中，尽管免疫治疗取得了显著进展，如T细胞激活的免疫检查点阻断（ICB）治疗和CAR-T细胞疗法，但仍然存在多种因素恶化肺癌免疫治疗的效果，例如“冷”肿瘤中CD8+T细胞浸润稀缺，即所谓的免疫荒漠，导致中位总生存期较短，这可能与肺部肿瘤的复杂免疫抑制微环境有关。

先天免疫细胞在肺部肿瘤免疫抑制微环境中发挥着至关重要的作用。例如，大量浸润肺部肿瘤的巨噬细胞和树突状细胞（DCs）可能在肿瘤微环境（TME）中被驯化，从而促进肿瘤的发展。与其他类型的癌症相比，多样化的巨噬细胞类型使肿瘤免疫微环境变得日益复杂，例如骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）、肺泡巨噬细胞（AMs）和间质巨噬细胞（IMs），它们通过诱导血管生成、分泌各种因子以及通过多种途径抑制细胞毒性T细胞的反应来促进肿瘤的发展。此外，未成熟的树突状细胞也可以通过产生转化生长因子-β（TGF-β）和表达程序化细胞死亡蛋白1（PD-1）配体1（PD-L1）来抑制CD8+T细胞。因此，人们认为在当前盛行的基于T细胞的治疗之前或期间，肿瘤内的先天免疫逆转应该是抑制肺癌发展的关键。

由于大量的巨噬细胞可能会渗入肺部肿瘤微环境，通过激活巨噬细胞的抗肿瘤功能进行免疫治疗被认为是治疗肺癌的一种有前途的方法。然而，由于巨噬细胞的免疫记忆能力较差，仅基于巨噬细胞的肿瘤免疫治疗可能会引发人们对癌症复发和转移的担忧。因此，结合巨噬细胞/T细胞免疫治疗可以整合巨噬细胞快速反应的优势和T细胞强大的免疫记忆，可能实现更有效的治疗效果。经过广泛研究证实，作为一种刺激信号，钙调素（CRT）能够将巨噬细胞从抗炎的M2表型极化为促炎的M1表型，并激活抗原呈递的树突状细胞，进而通过抗原呈递激活T细胞。这样的钙调素可能成为肺癌免疫治疗的有效靶点，不幸的是，在原位肺癌治疗中很少有相关报道。另外，同样重要的是，高表达钙调素的肿瘤细胞可能通过在肿瘤细胞表面过度表达“别吃我”CD47检查点信号分子来逃避巨噬细胞的清除。因此，钙调素表达的上调和CD47蛋白的下调在加强巨噬细胞极化过程中发挥着关键作用。

研究进展

研究人员提出了一种针对原位肺肿瘤的联合免疫治疗策略，该策略通过建立基于亚微米层状双氢氧化物（LDH）的双小分子药物共递送系统，激活肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的抗肿瘤效应，诱导树突状细胞成熟，并通过树突状细胞的抗原呈递功能激活T细胞的抗肿瘤免疫反应。研究人员选择了对温和酸性响应并且具有微米级尺寸的Zn-Al LDH作为药物载体，用于装载和传递两种小分子药物，即钙通道抑制剂TTA-Q6和CD47抑制剂RRX-001。与其他纳米载体相比，亚微米大小和片状形态使LDH更有可能定位在肿瘤基质中，而不是进入癌细胞，从而使TTA-Q6能够发挥功能，因为钙通道抑制剂只能从细胞外空间进入钙通道。随后，这些分层纳米载体在酸性肿瘤微环境中释放这些间层载药物。这种以肿瘤微环境响应的药物释放为特征的联合免疫治疗策略可以成功诱导全身免疫反应，从而保证LDH/RRX-001/TTA-Q6共递送系统的良好生物安全性，此后称之为LRT纳米药物经过表面修饰。

作为一种特异的T型钙通道抑制剂，纳米药物释放的TTA-Q6阻止肿瘤细胞摄取细胞外钙离子，因此诱导细胞内钙缺乏和内质网（ER）应激，终导致CRT表达从内质网转运至细胞质膜上。此外，释放的RRX-001作为一种目前正在临床试验中的CD47抑制剂，可以下调肿瘤细胞膜上的CD47蛋白。随后，肿瘤细胞质膜上的CRT过表达和CD47低表达共同激活肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤效应，并诱导树突状细胞捕获肿瘤相关抗原并将其呈递给T细胞。本研究充分利用肺部肿瘤免疫微环境的调节作用，同时激活肺癌治疗中的先天和适应性免疫反应。在肺癌模型中，这种联合方法呈现出抗肿瘤效应，并对肿瘤再曝露产生免疫反应，突显了其在肺癌免疫治疗中的潜力。

LRT调节癌细胞中CD47和CRT的表达

研究人员使用可渗透的荧光钙指示剂Calbryte 520和流式细胞术来分析LRT对钙离子内流的抑制效果。还设置了LDH、LDH/RRX-001（LR）和LDH/TTA-Q6（LT）进行比较。如细胞学结果所示，经过LT或LRT处理的LLC细胞在加入钙离子后，钙荧光信号保持恒定，表明负载TTA-Q6的纳米药物能够大大抑制癌细胞从细胞外环境中摄取钙离子。此外，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进一步研究LLC细胞的细胞内钙水平。在LRT处理24小时后，LLC细胞中的钙探针Fluo-4荧光信号明显较弱，低于正常水平，即这些LLC细胞存在钙稳态缺乏，这将导致内质网应激。

内质网形态的改变是内质网应激的常见指标，可以通过透射电子显微镜观察到。根据生物TEM图像，与对照组中LLC细胞的正常内质网形态相比，LRT处理组的内质网显示出明显的水肿、扩张、空腔变性和颗粒溶解。此外，内质网应激伴随着内质网中蛋白质的错误折叠。在内质网应激条件下，内质网伴侣蛋白BIP（结合免疫球蛋白蛋白）结合未折叠蛋白，从而激活内质网应激传感器IRE1-α（肌醇需要酶1α），并上调内质网应激标记物CHOP（C/EBP同源蛋白）。根据通过蛋白质印迹分析测量得到的相关蛋白质表达情况，BIP、CHOP和IRE1-α蛋白在LT/LRT处理组中显著上调，这表明LT/LRT纳米药物已经在LLC细胞中诱导了内质网应激。

随后，作为内质网应激的结果，钙调蛋白质calreticulin转位到细胞表面作为“吞噬信号”被不同处理组直接通过CLSM检测到。在LT/LRT处理16小时后，LLC细胞中可以观察到明显的红色荧光信号，表明LRT纳米药物成功诱导了细胞质膜中的CRT暴露。通过流式细胞术对CRT暴露以及细胞表面CD47表达进行了定量评估。在接受LRT处理的LLC细胞中，CRT和CD47的表达分别上调和下调。这些在癌细胞表面的表达变化将激活巨噬细胞的抗肿瘤反应并促进DC的成熟。

研究结果

综上所述，本研究提出了一种针对原位肺肿瘤的联合免疫治疗策略，该策略通过建立基于亚微米层状双氢氧化物（LDH）的双小分子药物共递送系统，激活肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的抗肿瘤效应，诱导树突状细胞成熟，并通过树突状细胞的抗原呈递功能激活T细胞的抗肿瘤免疫反应。在肺癌模型中，这种联合方法呈现出抗肿瘤效应，并对肿瘤再曝露产生免疫反应，突显了其在肺癌免疫治疗中的潜力。