西南医科大学发文：发现肝癌治疗新靶点

8月6日，西南医科大学研究团队在期刊《Molecular Cancer》上发表了研究论文，题为“Circular RNA ACVR2A promotes the progression of hepatocellular carcinoma through mir-511-5p targeting PI3K-Akt signaling pathway”，本研究采用定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)或蛋白质印迹法(Western blot)测定circACVR2A、微小RNA (miR511-5p)和PI3K-Akt信号通路中相关蛋白的丰度。分别采用CCK-8、迁移实验和Tunel染色分析细胞活力、侵袭和凋亡。双荧光素酶报告基因实验评估了circACVR2A与microRNA的相互作用。circACVR2A在肝癌细胞株中高表达。体内外实验结果表明，circACVR2A促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在机制方面，研究人员发现circACVR2A可以直接与miR511-5p相互作用，并作为miRNA海绵调节PI3K-Akt信号通路中相关蛋白的表达。在HCC中，circACVR2A可通过介导miR-511-5p/mRNA网络激活PI3K信号通路。这表明，以circACVR2A为核心的分子调控网络是肝细胞癌诊断和治疗的潜在新靶点。

研究背景

肝细胞癌极其致命，每年有70多万人死于肝癌。我国每年约有40万新发肝细胞癌患者，约占全球新增肝细胞癌患者的50%。由于肝细胞癌患者的高复发率和不良预后，寻找新的、更有效的生物标志物作为肝细胞癌的检测靶点，或作为预防和治疗靶点显得尤为必要。

研究表明，circRNA在多种恶性肿瘤与正常组织之间存在稳定的表达差异，因此有学者认为部分circRNA可作为恶性肿瘤的理想生物标志物。circRNA还参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等生理过程。例如，hsa_circ_002059在胃癌、正常组织和血液样本中的表达存在显著差异，也显示出其作为生物标志物的潜在诊断价值。circ-ITCH在食管鳞状细胞癌组织中的表达明显低于癌旁组织。过表达circ-ITCH可显著抑制肿瘤细胞周期进展，从而抑制肿瘤生长。然而，目前关于circRNA是否可以作为肝癌的诊断和治疗靶点的研究较少。

circACVR2A可促进肝癌细胞增殖

研究人员通过CCK-8实验和细胞克隆形成实验探究circACVR2A是否影响肝癌细胞增殖。在过表达或敲低circACVR2A的肝癌细胞株Huh-7和Hep3B中，CCK8分别在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h检测细胞活力。与对照组相比，过表达circACVR2A可显著增强肝癌细胞Huh-7和Hep3B的细胞活力，而敲低circACVR2A会导致Huh-7和Hep3B细胞活力显著下降。在细胞克隆形成实验中，研究人员发现过表达circACVR2A增加了细胞克隆的数量，而沉默circACVR2A则减少了细胞克隆的数量，这表明circACVR2A在体外可以促进Huh-7和Hep3B细胞的肿瘤发生。

circACVR2A可促进肝癌细胞体外增殖

circACVR2A促进肝癌的侵袭和迁移

circACVR2A在肝癌细胞系Huh-7和Hep3B中过表达或敲低。研究人员通过细胞划痕实验和体外迁移细胞侵袭实验检测circACVR2A表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响。结果显示，在迁移实验中，与对照组相比，过表达circACVR2A细胞的生长速度明显快于敲低circACVR2A细胞的生长速度。提示circACVR2A可促进肝癌细胞中Huh-7和Hep3B的迁移;侵袭实验中，与对照组相比，过表达circACVR2A能促进更多的Huh-7和Hep3细胞通过迁移腔室，而敲低circACVR2A会导致较少的细胞通过迁移腔室。提示circACVR2A可促进肝癌细胞中Huh-7和Hep3B的侵袭。

circACVR2A可抑制肝癌细胞凋亡

研究人员采用TUNEL染色实验检测circACVR2A是否影响肝癌细胞凋亡。用circACVR2A过表达或沉默Huh-7和Hep3B后，制备细胞片，采用TUNEL染色试剂盒、TdT酶染色液和DAPI酶染色液进行染色。通过荧光显微镜观察并拍照，根据TUNEL染色结果。TUNEL阳性染色呈红色，形态和大小不一，以分散的形式随机分布于正常细胞中。对照组几乎无阳性细胞，过表达circACVR2A组几乎无提示凋亡的红色阳性细胞，两组细胞间无明显差异。而在敲低circACVR2A组(shRNA1和shRNA3)中，阳性细胞显著增加，且高于各自的对照组。这提示抑制circACVR2A可促进Huh-7和Hep3B细胞的凋亡。

circACVR2A可激活PI3K信号通路

为进一步验证circACVR2A可通过PI3K信号通路发挥致癌作用，研究人员采用蛋白质免疫印迹法检测Huh-7和Hep3B细胞株过表达和沉默circACVR2A后PI3K信号通路相关蛋白的表达。结果显示，过表达circACVR2显著增强了PI3K、p-PI3K、p-AKT和p-FoxO1的表达，显著抑制了FoxO1的表达，而沉默circACVR2A则呈现相反的结果。此外，研究人员还检测了肝癌细胞株Huh-7和Hep3B中凋亡相关蛋白Bax/Bcl2的表达。在肝癌细胞株Huh-7和Hep3B中过表达circACVR2可显著抑制Bax的表达，增强Bcl2的表达，而沉默circACVR2A后结果则相反。这表明circACVR2A介导的调控网络可上调PI3K-AKT信号通路，发挥致癌作用。

circACVR2A可促进肝癌的体内生长

为了进一步验证circACVR2A在体内对肿瘤生长的影响，研究人员构建了稳定表达circACVR2A和其对照载体的Hep3B细胞，并根据细胞实验结果选择shRNA1沉默Hep3B细胞的circACVR2A敲低细胞。选择约5-6周龄的裸鼠BALB/c，将过表达或敲低circACVR2A及其对照组的细胞注射到小鼠右侧腋窝。细胞接种后一周，各组均出现肿瘤生长，每3天测量并记录肿瘤体积。接种21天后，小鼠被处死，取出肿瘤组织并称重。结果显示，与对照组相比，circACVR2A过表达组肿瘤组织明显出现坏死。此外，circACVR2A过表达组的肿瘤体积和重量显著增加，而敲低组的肿瘤体积和重量与对照组相比显著降低。研究人员采用HE染色检测各组肿瘤的生长情况。结果显示，过表达circACVR2A组的肿瘤坏死细胞面积显著大于对照组，而敲低circACVR2A组的肿瘤坏死细胞面积显著小于对照组。这表明在肝癌中下调circACVR2A表达可以抑制肿瘤的体内生长。

研究小结

总之，研究表明，circACVR2A在肝细胞癌细胞系中的表达上调，其高表达与肝细胞癌的进展密切相关。就机制而言，circACVR2A可通过直接与miR-511-5p结合，显著抑制肝细胞癌的增殖和转移，从而降低miR-511-5p对PI3K信号通路的抑制作用。因此，以circACVR2A为核心的分子调节网络可能是治疗肝癌的新靶点。