南京医科大学发文：促进巨噬细胞极化和乳腺癌进展的新机制

8月6日，南京医科大学研究团队在期刊《Clinical and Translational Medicine》上发表了题为“Exosomal circ-0100519 promotes breast cancer progression via inducing M2 macrophage polarisation by USP7/NRF2 axis”的研究论文，本研究中，研究人员发现Circ-0100519在BC肿瘤组织中显著富集，并与不良预后相关。它可以被包裹到分泌的外泌体中，从而通过诱导m2样巨噬细胞极化促进BC细胞的侵袭和转移。在机制上，circ-0100519作为支架增强巨噬细胞中去泛素化酶泛素特异性蛋白酶7 (USP7)和核因子样2 (NRF2)之间的相互作用，诱导USP7介导的NRF2去泛素化。此外，HIF-1α可以作为上游效应因子增强circ-0100519的转录。本研究表明外泌体circ-0100519是乳腺癌诊断和预后的潜在生物标志物，HIF-1α抑制剂PX-478可能为乳腺癌提供治疗靶点。

背景知识

乳腺癌(Breast cancer, BC)是一种异质性很大的疾病，是多种因素共同作用的结果。根据雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长因子受体2 (human epithelial growth factor receptor 2, HER2)的表达情况，乳腺癌在临床上可分为三大类:ER+、HER2+和三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)。即使采用以手术为主的综合治疗手段，仍有一部分乳腺癌患者面临术后复发、转移和化疗耐药的威胁，严重威胁患者的生存。因此，进一步了解BC进展背后的分子过程对改善患者预后至关重要。

肿瘤微环境(TME)是一个复杂的生态系统，由多种细胞类型和分泌的因子组成，具有抗肿瘤和促肿瘤的双重作用。随着肿瘤的进展，它进一步利用免疫和神经内分泌系统诱导一种有利于肿瘤扩张的稳态。在TME的组成部分中，肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是重要的，广泛参与调节肿瘤的进展。根据不同的微环境和刺激，巨噬细胞可以向不同方向极化，主要分为肿瘤抑制(M1型)和肿瘤促进(M2型)两种状态。TAMs显著的可塑性及其在肿瘤发展中的关键作用强调了TAMs将成为BC治疗的关键靶点。

外泌体是一种纳米大小的囊泡，直径从30到150纳米不等，由多种细胞分泌。外泌体通常会转移多种非编码RNA，包括环状RNA、微RNA和长链非编码RNA，并在复杂的细胞间通讯网络中发挥重要作用。越来越多的证据表明，肿瘤源性外泌体通过促进上皮-间质转化(EMT)、诱导血管生成、介导免疫逃避和调节巨噬细胞极化等多种过程促进肿瘤发生。本研究旨在探讨外泌体调控乳腺癌TME的机制。

外泌体circ-0100519促进体外BC细胞增殖和转移

研究人员在BT-549细胞中转染了shcirc-0100519，发现EPSTI1的水平没有受到影响，而circ-0100519的表达降低，表明circ-0100519是转录后水平的变化。为了探索circ-0100519在BC中的作用，研究人员在BT-549和T-47D细胞中沉默circ-0100519，并发现在体外下调circ-0100519不能抑制肿瘤细胞增殖。研究人员将BT-549和T-47D细胞与预处理的THP-1细胞共培养，采用集落形成实验、EdU实验、CCK-8实验、流式细胞术细胞凋亡实验和迁移实验研究circ-0100519对BC细胞增殖和转移的影响。结果表明，下调circ-0100519显著抑制细胞活力和迁移。流式细胞术检测提示，shcirc-0100519组F4/80+CD206+细胞比例较shNC组明显降低。此外，研究人员使用BMDM进一步证实了流式细胞术的结果。通过检测THP-1与BT-549共培养后M1样细胞因子和趋化因子的释放，研究人员发现circ-0100519不能影响TAMs的M1激活，表明抑制circ-0100519只影响M2激活。为探究含circ0100519的外泌体能否转运至巨噬细胞，研究人员将BC细胞与PMA诱导的THP-1细胞共培养，通过qRT-PCR计算巨噬细胞中circ-0100519的含量。为了进一步验证巨噬细胞可以吞噬外泌体和circ-0100519，研究人员将外泌体与巨噬细胞共培养，通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞吞噬红色荧光标记的外泌体和绿色荧光标记的外泌体包裹的circ-0100519。此外，当研究人员使用外泌体抑制剂GW4869处理共培养体系时，上述circ-0100519的促肿瘤作用被逆转。GW4869或DMSO不与乳腺癌细胞共培养，而直接作用于乳腺癌细胞，未发现细胞增殖有明显差异。综上所述，这些数据表明circ-0100519可以被外泌体包裹和释放。本研究可能不涉及非外泌体依赖性效应。

外泌体circ-0100519促进体外BC细胞增殖和转移

外泌体circ-0100519通过改变体内M2样巨噬细胞的极化来促进BC的发展

研究人员采用梯度浓度(0、10、25、50、100µg)的BT-549细胞外泌体与THP-1细胞共培养，检测巨噬细胞中circ-0100519的表达。根据qRT-PCR结果，研究人员选择50µg作为后续实验的较佳浓度。为验证外泌体circ-0100519的体内致癌作用，建立小鼠致瘤模型，每只小鼠每3天静脉注射BT-549产生的外泌体50µg。第28天处死小鼠，收集肿瘤组织。正如预期的那样，与对照组相比，注射shcirc-0100519外泌体延长了生存时间，并降低了肿瘤的体积和重量。同时，shcirc-0100519外泌体处理的荷瘤小鼠Ki67增殖指数降低。为了探索shcirc-0100519外泌体如何抑制肿瘤扩张，研究人员研究了这些shcirc-0100519外泌体诱导的恶性肿瘤是否表现出极化抑制的M2巨噬细胞活性。与shNC外泌体组相比，shcirc-0100519外泌体处理后M2标志物表达下降。此外，shcirc-0100519外泌体处理的小鼠肿瘤组织中F4/80+CD206+巨噬细胞表达减少。通过使用肺转移模型，研究人员发现shcirc-0100519组的肿瘤负荷和肺转移发生率低于shNC组。另外，研究人员收集了5例BC患者的病理穿刺样本，发现转移性乳腺癌患者肿瘤组织中circ-0100519的表达水平显著高于非转移患者，这与肺转移小鼠模型一致。这些结果表明外泌体circ-0100519也可以通过促进M2样巨噬细胞极化来促进体内BC肿瘤的增殖和转移。

研究小结

综上所述，本研究确定了circ-0100519在BC中显著表达，并通过外泌体进入TAMs。它通过circ-0100519/USP7/NRF2轴调控M2型巨噬细胞极化，从而促进BC的进展。研究人员进一步验证了HIF-1α可能是circ-0100519的上游效应因子。这些发现不仅揭示了circ-0100519在乳腺癌发生发展中的重要作用，而且为乳腺癌提供了一个治疗靶点，为未来的治疗策略提供了新的方向。