南昌大学/清华大学合作发文：发现结直肠癌的靶向治疗新策略

8月20日，南昌大学与清华大学研究团队合作在期刊《Cell Death Discovery》上发表了研究论文，题为“Linear polyubiquitylation of Gli protein regulates its protein stability and facilitates tumor growth in colorectal cancer”，在本研究中，研究人员发现LUBAC（线性聚泛素化连接酶）是Hedgehog（Hh）信号通路的关键转录因子Gli蛋白的新型底物。线性聚泛素化能稳定Gli蛋白，导致CRC细胞非经典Hh信号通路激活。此外，LUBAC促进CRC细胞的肿瘤生长。另外，在CRC组织中观察到了LUBAC成分的高表达，这些成分在CRC患者中的表达水平越高，预后越差。但是，使用小分子激动剂或RNA沉默抑制LUBAC活性，可特异性地抑制CRC细胞的生长，且对正常肠道细胞无影响。综上所述，LUBAC成分的异常表达通过介导线性聚泛素化激活非经典Hh信号通路，促进CRC肿瘤生长，展示了线性聚泛素化在调节其底物蛋白质稳定性方面的新功能，并凸显了靶向LUBAC作为CRC治疗策略的潜力。

背景知识

泛素化是细胞中蛋白质常见的一种后翻译修饰方式，对蛋白质的功能和命运有着重要的调控作用。泛素通常通过其表面的7个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K48和K63）聚合，而线性的泛素链（也称为M1-泛素链）则通过泛素的N-端甲硫氨酸残基（M1）连接。

虽然许多研究报告已经分别确定了LUBAC各组成部分的功能，但线性泛素化在肿瘤中的作用仍不清楚。早期研究发现，HOIP通过使p53单泛素化并降低其稳定性，从而促进乳腺癌细胞的药物抵抗。据报道，Sharpin在胃癌中通过独立于线性泛素化的方式稳定β-连环蛋白，从而促进Wnt信号通路。LUBAC的另一个组成部分HOIL-1通过稳定雌激素受体α（ERα）促进乳腺癌肿瘤生长，但线性泛素化是否参与这一过程仍不清楚。

由于在细胞命运决定和细胞增殖中的关键作用，Hh信号通路的超活化在多种肿瘤中促进了肿瘤发生和癌症进展，例如髓母细胞瘤、肝细胞癌、胃癌和结直肠癌。因此，Hh信号通路受到严格的负反馈调节；尤其是，Gli蛋白的蛋白质稳定性受到多个泛素E3连接酶和通过泛素化依赖的蛋白质降解的去泛素化过程的精确调控。

HOIP促进CRC细胞生长

虽然临床分析揭示了LUBAC与结直肠癌之间的关联，但还需要进行进一步的实验来阐明LUBAC是否促进肿瘤生长和进展。

研究人员在两种不同的结直肠癌细胞系HCT-116和SW480中构建了HOIP的异位表达。克隆形成实验表明，HOIP在两种结直肠癌细胞系中都促进肿瘤细胞生长，这一结论在软琼脂中的球形形成实验中得到了进一步证实。此外，研究人员使用CCK-8试剂盒每天对细胞进行活体检测，以生成细胞生长曲线，结果显示HOIP促进结直肠癌细胞的增殖。

图1：HOIP促进CRC细胞生长

为了进一步测试HOIP在CRC中的作用，研究人员在裸鼠中建立了异种移植模型。结果显示，外源性表达HOIP会导致CRC肿瘤生长加快，肿瘤体积和重量均显著增加。免疫组化染色显示，HOIP表达增加了细胞增殖，因为Ki67阳性细胞的数量增加了。

总之，这项研究阐明了HOIP与结直肠癌之间的关联，并进一步证明HOIP在体外和体内均可促进结直肠癌细胞的肿瘤生长。

HOIP抑制CRC细胞生长

相反，通过在HT-29和HCT-116细胞中使用shRNA进行稳定的HOIP干扰，也评估了HOIP缺失的效果。在两种细胞系中，HOIP敲低降低了克隆形成能力并抑制了球形形成，这表明HOIP缺失对CRC细胞的增殖具有抑制作用。

研究人员鉴定并合成了几种靶向LUBAC的小分子化合物，此前这些化合物被称为HOIPINs。研究人员进一步证实，HOIPIN-1和HOIPIN-8可以通过与HOIP结合并通过功能试验和晶体结构抑制线性泛素化，从而抑制LUBAC。因此，研究人员测试了小分子对CRC细胞中LUBAC的抑制效果。克隆形成试验表明，HOIPIN-1以剂量依赖的方式抑制HCT-116和HT-29细胞的肿瘤细胞生长，细胞生长曲线也得出了类似的结论。

为了进一步探索HOIPIN-1在结直肠癌治疗中的潜力，研究人员使用了来自结直肠组织的患者来源的器官样体（PDOs）。如图2E和F所示，HOIPIN-1治疗减少了PDOs的数量，并抑制了Ascl2和Axin2的表达，表明HOIPIN-1对结直肠器官样体的干细胞特性和细胞增殖具有抑制作用。尤其是，HOIPIN-1只抑制了来自结直肠组织的器官样体的生长，而对来自正常肠道组织的器官样体没有影响，这表明LUBAC在肿瘤或正常组织中的功能是内容依赖的。

图2：HOIP抑制结直肠癌细胞的生长

由于铂类药物在结直肠癌（CRC）的临床化疗中被广泛使用，研究人员研究了HOIPIN-1与顺铂联合治疗CRC细胞的效果。如图2H所示，HOIPIN-1或顺铂均可抑制HCT-116细胞的生长，这两种分子的联合作用可显著抑制CRC细胞的生长，这表明将HOIPIN-1与其他化疗药物联合应用是CRC治疗的一种有前景的策略。

综上，通过RNA干扰或小分子抑制LUBAC后，在CRC细胞和PDOs中均显著抑制了细胞生长，这表明LUBAC是CRC治疗的一个新颖且有前途的靶点。

研究小结

总之，本研究发现，Gli蛋白是线性多泛素化的新型底物，这有助于Hh信号通路的激活并促进结直肠癌细胞的增殖。