同济大学向作林教授团队：揭示肝癌转移新机制

8月27日，同济大学向作林教授团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“Circ-0044539 promotes lymph node metastasis of hepatocellular carcinoma through exosomal-miR-29a-3p”，本研究中，研究人员通过微阵列分析和生物信息学分析，确定circ-0044539-miR-29a-3p-VEGFA轴是HCC淋巴结转移进展的潜在关键因素。在肝癌细胞和裸鼠中，circ-0044539表达下调或miR-29a-3p表达上调与肿瘤体积小、PI3K-AKT-mTOR通路失活、关键淋巴结转移因子(HIF-1α和CXCR4)表达下调相关。此外，circ-0044539还负责外泌体miR-29a-3p的分泌。外泌体miR-29a-3p可迁移至淋巴结并下调多形核髓源性抑制细胞(PMN-MDSCs)中高迁移率族转录因子1 (Hbp1)的表达，诱导形成适合肿瘤定植的微环境。综上所述，circ-0044539通过外泌体促进HCC细胞的淋巴结转移能力，并在淋巴结中诱导免疫抑制环境，突出了其作为HCC淋巴结转移和HCC免疫治疗靶点的潜力。

背景知识

肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏肿瘤，全球发病率高，在癌症相关死亡率方面排名第二，仅次于胰腺癌。淋巴结转移是HCC最常见的肝外转移类型之一，极大地影响了HCC患者的生存和生活质量。尽管HCC的诊断和治疗取得了显著的进步，但由于患者症状较轻，难以发现淋巴结转移。此外，肝癌淋巴结转移的特异性生物标志物和潜在机制仍不清楚。因此，迫切需要全面阐明参与淋巴结转移的分子机制，以完善HCC患者的干预和诊断策略。

环状RNA(Circular RNAs, circRNAs)由于其独特的环状结构，表现出高度的保守性和稳定性，使其成为血清中潜在的分子生物标志物。circRNAs被发现与HCC发病的多种机制相关，包括免疫抑制环境的形成、血管生成、基质重塑、缺氧、细胞外囊泡的释放和放化疗抵抗。circRNAs作为无创生物标志物的巨大潜力及其在靶向治疗中的临床价值已受到广泛关注。然而，circRNAs在HCC淋巴结转移中的具体作用尚不清楚。本研究旨在验证circ-0044539在HCC中的生物学作用，探讨其参与HCC淋巴结转移过程的分子机制，为开发HCC淋巴结转移患者的新型临床诊断标志物和治疗靶点提供理论支持。

髓源性抑制细胞(myeloid -derived suppressor cells, MDSCs)是在骨髓中产生的一群异质性髓系细胞。在荷瘤宿主中，MDSCs向外周淋巴器官和肿瘤迁移，促进局部免疫抑制微环境的形成。不同肿瘤组织和器官中MDSCs的表型存在显著差异，这表明MDSCs的分化和聚集可能是肿瘤细胞依赖的。这表明血液和免疫器官(如淋巴结)中的MDSCs可能受到癌细胞的调控。虽然MDSCs在LN和HCC组织中的抑制作用已被证实，但在HCC到来之前，MDSCs与淋巴结转移前微环境的调控网络仍未被探索。

Circ-0044539在体外促进肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭

Circ-0044539在高侵袭转移潜能的MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6细胞株中的表达水平高于低侵袭转移潜能的MHCC97L细胞株。与正常肝细胞L02细胞株相比，这些肝癌细胞株的circ-0044539表达水平较高。此外，circ-0044539表现出对RNase R处理的抗性，而COL1A1的线性亚型则没有。其稳定性也高于COL1A1 mRNA。过表达circ-0044539后，细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增强，而抑制circ-0044539后，细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低。这些发现说明了circ-0044539在肝癌细胞中的致癌作用。

MiR-29a-3p在体外抑制肝癌的恶性行为，逆转circ-0044539诱导的促肿瘤作用

为了验证假设，研究人员构建了miR-29a-3p敲低和过表达细胞系，尽管miR-29a-3p的上调或下调，但circ-0044539的表达没有受到影响。miR-29a-3p有效地抑制了细胞的生长活性，显著降低了HCC细胞的迁移和侵袭能力。miR-29a-3p的下调激活了PI3K-Akt-mTOR信号通路，并增加了HIF-1α和CXCR4的蛋白表达水平。此外，VEGFA可以减轻由miR-29a-3p介导的这些效应。

双荧光素酶报告基因实验证实circ-0044539与miR-29a-3p存在直接相互作用。为了进一步研究circ-0044539-miR-29a-3p轴在HCC进展中的作用，研究人员进行了挽救实验。此外，研究人员发现circ-0044539可能与培养条件、细胞密度和细胞倍增时间相关，影响肝癌细胞系中miR-29a-3p的表达水平。挽救实验结果显示，过表达circ-0044539对细胞增殖、迁移和侵袭能力的促进作用可被miR-29a-3p逆转;敲低circ-0044539介导的抑制作用可被抑制miR-29a-3p逆转。如图1G所示，circ-0044539增加了PI3K-Akt-mTOR信号通路的磷酸化水平，增加了HIF-1α和CXCR4的蛋白表达，这些作用被miR-29a-3p逆转。综上所述，这些结果表明miR-29a-3p表现出抗癌作用，并通过直接结合circ-0044539在HCC中部分介导了其致癌功能。

图1：Circ-0044539在体外通过miR-29a-3p调控肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力

血清circ-0044539和血浆外泌体miR-29a-3p是HCC淋巴结转移的特异性生物标志物

研究人员评估了124例HCC患者的血清circ-0044539浓度，发现淋巴结转移组血清circ-0044539显著高于淋巴结非转移组。此外，研究人员发现血浆外泌体中miR-29a-3p的水平在有淋巴结转移的HCC患者中显著升高。循环circ-0044539和外泌体miR-29a-3p可能是诊断HCC淋巴结转移的潜在生物标志物。

研究小结

总之，本研究表明，circ-0044539可以影响HCC细胞和LN微环境，从而促进HCC的淋巴结转移。Circ-0044539通过miR-29a-3p增强肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。在HCC细胞中，circ-0044539通过hif -1α依赖通路上调CXCR4的表达并促进富含miR-29a-3p的细胞外泌体的释放。这些外泌体影响PMN-MDSCs中Hbp-1的表达，从而增强PMN-MDSCs的免疫抑制功能。体内实验明确表明，高表达circ-0044539的肝癌细胞来源的外泌体靶向淋巴结，形成促进肝癌淋巴结转移的转移前淋巴结微环境。本研究发现circ-0044539在组织和血清中的表达可能是HCC淋巴结转移的潜在生物标志物。这些结果表明，原发性肝癌细胞通过获得较高的circ-0044539表达水平，不仅获得了选择性的生存优势，还具有向特定器官迁移的倾向：淋巴结，这可能导致远处扩散和免疫抑制。