北京大学邓宏魁团队成功研发双属性iTNK细胞

2024年8月30日，北京大学生命科学学院邓宏魁团队在期刊《Cell Reports Methods》上发表了题为“Generation of dual-attribute iTNK cells from hPSCs for cancer immunotherapy”的研究论文。在这项研究中，团队从hPSC生成双属性诱导的T-NK（iTNK）细胞，表达细胞毒性T和NK细胞的标志物。单细胞RNA和T细胞受体（TCR）测序分析显示，iTNK细胞表达与NK和T细胞相关的特征基因，并表现出多样化的TCR库。iTNK细胞释放细胞毒性介质，对多种肿瘤细胞系发挥细胞毒性，并在体内抑制肿瘤生长。通过利用适应性和先天免疫反应，hPSC衍生的iTNK细胞，为癌症免疫治疗，提供了有前途的策略。

研究背景

双属性免疫细胞结合了细胞毒性T细胞和自然杀伤（NK）细胞的优势，为免疫疗法提供了一种有吸引力的途径。不变的自然杀伤T（iNKT）细胞，具有独特的识别特性，通过多种机制的溶细胞特性显示出前景，但可用性有限。人体血液中含有极少量的iNKT细胞，在许多癌症患者中，它们的数量和功能减少，这限制了它们在癌症治疗中的潜在临床应用。为了克服这一限制，体外扩增的iNKT细胞，来自iNKT细胞来源的诱导多能干细胞（iPSC）的再分化iNKT细胞和造血干细胞工程iNKT细胞已经产生，并显示出癌症治疗的潜力。

以前的研究通过在体外对原代T淋巴细胞进行基因编辑或培养，来产生双属性免疫细胞。Bcl11b的基因缺失将T细胞重编程为诱导的T到NK（ITNK）细胞，这些细胞表现出NK细胞特性，并降低一些T细胞特征基因的表达。人ITNK细胞也可以通过使脐带血或外周血T细胞中的BCL11B失活来产生。这些细胞表现出先天性和适应性特征，显示出不依赖T细胞受体（TCR）的抗肿瘤细胞毒性。涉及自体ITNK细胞的临床研究，显示出有希望的结果，患者经历了肿瘤稳定和部分缓解。此外，细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞，包括CD3CD56细胞，在癌症治疗结果方面表现出一些改善。迄今为止的证据表明，双属性细胞在肿瘤免疫治疗中，具有相当大的潜在用途。

然而，获得足够的双属性细胞以进行广泛的临床使用，仍然是一个挑战。人类多能干细胞（hPSC），例如，胚胎干细胞（ESC）、23iPSCs和化学诱导的多能干细胞（CiPSC），为产生丰富的功能细胞，提供理想的细胞来源。然而，科学界尚未实现从hPSC生产用于临床应用的双属性细胞。

为了解决这一限制，这项研究介绍了一种从hPSC生产双属性诱导的T-NK（iTNK）细胞的方法。产生并富集造血祖细胞（HPC），以诱导T细胞谱系的产生；随后，成功生成了iTNK细胞。这些细胞同时表达CD8 T细胞和NK细胞特征基因，表现出多样化的TCR库，并在刺激和杀伤过程中，释放高水平的各种细胞毒性介质。iTNK细胞通过来自CD3-TCR复合物和NK受体的信号传导，对各种肿瘤细胞系，表现出有效的细胞毒性。此外，低剂量的iTNK细胞有效地抑制了体内肿瘤生长。研究结果表明，使用一种有前途的杀伤细胞类型，开发增强型癌症免疫疗法的潜力。

图形摘要

研究进展

在3D和2D系统中将hPSC分化为HPC

淋巴样细胞来源于造血干细胞/祖细胞，因此，需要诱导HPC作为初步步骤。通过优化团队之前的协议，团队成功地建立了一个化学定义的方案，用于3D和2D系统中序贯中胚层诱导和造血诱导。这是使用人CiPSC（hCiPSC）系CiPS-3、hESC系H1和hiPSC系iPS-7实现的。在3D系统中，hPSCs发生自聚集，形成胚胎体。经过10天的诱导期后，团队获得了CD34 HPC，由大约2/3的CD31CD43CD45细胞和1/3的CD31CD43组成CD45系列细胞。在2D系统中，hPSC接种在玻连蛋白包被的平板上，并以2D形态分化。经过12天的诱导期后，产生的CD34HPC主要是CD31CD43CD45细胞。CD34 HPC在3D和2D系统中的平均纯度，约为24%和30%。就产量而言，100万个hPSC在3D系统中产生了大约45万个CD34HPC，而它们在2D系统中产生了316万个CD34 HPC。在两个系统中，所有3种细胞系，都可以分化为HPC。

从hPSC生成iTNK细胞

iTNK细胞对肿瘤细胞具有强效的细胞毒性

团队构建了异位表达OKT3的OKT3 NALM-6细胞，用于CD3-TCR复合物刺激，iTNK细胞有效裂解OKT3 NALM-6细胞，但表现出对NALM-6细胞的有限裂解，表明iTNK细胞可以通过OKT3刺激，实现细胞毒性。iTNK细胞还对实体瘤细胞系表现出有效的细胞毒性，包括HCT116、HepG2、A375和MDA-MB-231。与NK细胞类似，iTNK细胞可以在4小时内实现肿瘤细胞杀伤，并在12小时内表现出更高的效率。NKp30的抑制，降低了iTNK细胞对A375细胞的杀伤效率。因此，iTNK细胞通过CD3-TCR复合物介导和NK受体介导的肿瘤细胞杀伤细胞毒性，表现出双重靶向。

在与HCT116肿瘤细胞共培养时，与NK细胞相比，iTNK细胞释放更高水平的IFN-γ、颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、IL-17A、颗粒溶血素、IL-2和IL-10。在与NALM-6-OKT3肿瘤细胞共培养时，iTNK细胞表现出比T细胞更高水平的颗粒酶A、颗粒酶B、穿孔素、IL-17A、颗粒溶血素、IL-10和sFasL。此外，T细胞中IFN-γ的释放水平较高。这些结果表明，iTNK细胞在肿瘤杀伤过程中，表现出更大的多样性和更高水平的细胞毒性介质。

iTNK细胞在3周内显著抑制HCT116结直肠癌异种移植模型中的肿瘤生长，而不会对小鼠体重或外观造成不利影响。在iTNK细胞注射后3天，检测到小鼠血液中穿孔素、颗粒溶血和IFN-γ的释放。观察到iTNK细胞浸润到肿瘤、肝脏、肺和脾脏中。这些结果表明iTNK细胞的体内功能。

iTNK细胞的活化和细胞毒性

研究结论

这项研究成功地展示了iTNK细胞强大的肿瘤杀伤能力，并为它们从hPSC衍生，建立了稳健的方法。iTNK细胞用于肿瘤免疫治疗的潜力是巨大的。鉴于iTNK细胞表现出的细胞毒性T细胞和NK细胞的双重属性和组合功能，本研究为开发以iTNK细胞为中心的创新免疫治疗策略，铺平了道路。