福建医科大学/福州大学合作发文：发现胰腺癌潜在生物标志物和治疗策略

10月11日，福建医科大学与福州大学研究人员合作在期刊《Cell Death&Disease》发表了研究论文，题为“cNEK6 induces gemcitabine resistance by promoting glycolysis in pancreatic ductal adenocarcinoma via the SNRPA/PPA2c/mTORC1 axis”，在这项研究中，研究人员旨在确定一种生物标志物，可以稳健地表明PDAC对吉西他滨固有耐药，并指导化疗增敏策略。本实验室建立了吉西他滨耐药细胞株，并收集了吉西他滨治疗患者的胰腺癌和癌旁正常组织，观察到circRNA hsa_circ_0008383（即cNEK6）在吉西他滨耐药的PDAC患者外周血、肿瘤组织和异种移植瘤中高表达，cNEK6通过促进糖酵解增强PDAC对吉西他滨的耐药。因此，在cNEK6高表达的患者中，吉西他滨的治疗效果有限，联合mTORC1抑制剂雷帕霉素可增强对吉西他滨化疗的敏感性。

背景信息

胰腺癌是一种高度恶性的肿瘤，相当一部分胰腺导管腺癌（PDAC）患者在确诊时就失去了接受根治性手术的机会。即使是胰腺导管腺癌患者，术后也会出现局部复发或远处转移。因此，PDAC的辅助治疗非常必要。然而，许多患者对联合化疗中常用的一线和基石药物吉西他滨耐药，从而导致化疗不敏感，延误治疗。目前，尚缺乏能够准确指示胰腺癌是否对吉西他滨耐药的明确标志物；因此，确定可靠的生物标志物可以精确地指示PDAC对吉西他滨的敏感性，并提供合适的化疗增敏策略是必要的。

越来越多的证据表明，包括糖、脂、氨基酸代谢在内的肿瘤代谢可极大地影响PDAC化疗的疗效。肿瘤在很大程度上依赖于糖酵解产生的能量和代谢产物。吉西他滨产生的活性氧引起的氧化应激使糖酵解关键酶如丙酮酸激酶M2、甘油醛3-磷酸脱氢酶（GAPDH）失活，有效杀伤肿瘤。胰腺癌细胞通过增强糖酵解，利用糖酵解代谢产物抵抗吉西他滨。因此，充分了解PDAC促进糖酵解的分子机制将有助于开发潜在的吉西他滨化疗增敏策略。

SNRPA是一种RNA结合蛋白，能够识别剪接位点并促进剪接体的后续组装。SNRPA除了作为剪接相关的调控因子，还可以与 G4结合，G4是一种由富含重复鸟嘌呤（guanine， G）的DNA或RNA序列折叠形成的高级结构，在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。与翻译起始位点上游G4结构结合的蛋白质可以阻止核糖体与靶基因结合，从而阻断翻译。SNRPA在多种癌症中异常升高，并促进肿瘤的发生、发展和转移。SNRPA或G4是否参与增强糖酵解和PDAC对吉西他滨的耐药有待研究。

cNEK6促进PDAC对吉西他滨化疗耐药

为了鉴定与PDAC中吉西他滨化疗耐药相关的circRNA，研究人员构建了吉西他滨耐药的PDAC细胞株PANC-1 GR，通过circRNA测序分析PANC-1 GR组与野生型（WT） PANC-1组之间差异表达的circRNA。同时，研究人员分析了两个GEO数据集：GSE110580和GSE69362。将差异表达的circRNA与Venny取交集，筛选出1个在所有3个数据集中吉西他滨耐药组中显著高表达的circRNA hsa_circ_0008383。研究人员将hsa_circ_0008383命名为circ-NEK6 （cNEK6）。

cNEK6促进PDAC对吉西他滨化疗耐药

实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）证实，与野生型对照组相比，cNEK6在吉西他滨耐药的PDAC细胞株（PANC-1 GR和PaTu8988t GR）中高表达。在PANC-1 GR和PaTu8988t GR细胞株中敲低cNEK6后，吉西他滨耐药组对吉西他滨更敏感，IC50值和细胞活性降低，吉西他滨处理后形成克隆的能力减弱。相反，在对照组中，cNEK6过表达导致显著的吉西他滨耐药。研究人员收集PDAC患者的肿瘤样本，采用RT-qPCR检测cNEK6的表达，并构建裸鼠移植瘤模型。诱导成瘤后给予吉西他滨治疗。cNEK6高表达的肿瘤生长较快，对吉西他滨耐药，裸鼠结局较差。此外，研究人员收集了PDAC患者化疗前的肿瘤活检标本，并根据其原接受吉西他滨单药化疗患者的化疗结局将肿瘤标本分为部分/完全缓解（PR/CR）组和疾病进展/稳定（PD/SD）组。CircRNA原位杂交（ISH）分析显示，cNEK6在PD/SD组中高表达，总体生存率和无病生存率较差。上述体内、体外实验及临床数据表明，cNEK6与PDAC中吉西他滨化疗耐药呈正相关。

cNEK6可作为应用mTORC1抑制剂增敏吉西他滨化疗的生物标志物

鉴于cNEK6通过激活mTORC1通路促进糖酵解，研究人员使用PDAC细胞系中的mTORC1抑制剂来探究是否可以使高表达cNEK6的PDAC细胞对吉西他滨化疗产生敏感性。正如预期的那样，mTORC1抑制剂雷帕霉素显著抑制了高表达cNEK6的PDAC细胞的糖酵解，并有效地增强了这些细胞对吉西他滨化疗的敏感性。此外，通过检测外周血中cNEK6的水平，将异种移植肿瘤模型分为高表达cNEK6组和低表达cNEK6组，在应用mTORC1抑制剂时，吉西他滨显著降低了高表达cNEK6肿瘤的大小和体积，并延长了小鼠的生存时间。H&E染色和Ki-67免疫组化染色证实，雷帕霉素增强了吉西他滨在高表达cNEK6肿瘤中的杀伤作用。鉴于在体外抑制SNRPA显著抑制糖酵解，补充PP2Ac抑制mTORC1通路，研究人员调查了是否可以靶向SNRPA-PP2Ac来产生与体内雷帕霉素相似的化疗敏感化效应。研究人员在体内实验中采用了SNRPA抗体或补充了PP2Ac重组蛋白，但效果不明显。与能够有效抑制肿瘤中mTORC1通路激活的雷帕霉素相比，SNRPA抗体或PP2Ac重组蛋白无法有效调节肿瘤中SNRPA或PP2Ac的表达和mTORC1通路，这表明，体内抗体和重组蛋白的降解或无效递送可能是导致不满意结果的部分原因。

上述体外和体内实验结果表明，cNEK6能够激活mTORC1通路，并可作为一种生物标志物，这提示可在吉西他滨化疗中加入mTORC1抑制剂，以有效抑制PDAC。