中山大学张弩教授团队：发现肿瘤免疫治疗新靶点

10月30日，中山大学张弩教授研究团队在期刊《Cell Reports Medicine》上发表了研究论文，题为“Lnc-H19-derived protein shapes the immunosuppressive microenvironment of glioblastoma”，本研究中，研究人员发现长链非编码RNA (LncRNA) H19编码一种称为H19-IRP的免疫相关蛋白。H19- irp从H19 RNA中分离出来，通过与CCL2和Galectin-9启动子结合并激活其转录，从而促进GBM免疫抑制，进而招募髓源性抑制细胞（MDSCs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），导致T细胞耗竭和免疫抑制性GBM- TME。H19-IRP在临床GBM样本中过表达，作为主要组织相容性复合体I类（MHC-I）呈递的肿瘤相关抗原（TAA）发挥作用。靶向H19-IRP的环状RNA疫苗（circH19-vac）可触发针对GBM的强效细胞毒性T细胞应答，并抑制GBM生长。本研究结果强调了H19-IRP通过招募MDSCs和TAMs来产生免疫抑制性GBM-TME的功能，支持了以H19-IRP为靶点的肿瘤疫苗用于GBM治疗的想法。

背景信息

胶质母细胞瘤（GBM）是成人常见和致命的脑肿瘤。由于治疗方案有限，患者结局较坏，中位生存期不足2年。尽管目前可用的免疫疗法已被证明可使各种类型的癌症患者获益，包括结直肠癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌，但在GBM的免疫疗法临床试验中尚未证明满意的疗效和结局。

GBM对目前的免疫治疗方法显示出显著的耐药性。免疫检查点阻断（ICB）疗法是目前主流的免疫疗法，旨在增强T细胞的抗肿瘤能力。然而，GBM中密集的免疫抑制细胞，加上稀疏的T细胞浸润，严重限制了ICB的治疗效力。此外，免疫逃逸是包括GBM在内的恶性肿瘤的一个标志。GBM可通过DNA甲基化等表观遗传修饰增强肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）免疫抑制，促进免疫逃逸。免疫治疗失败的原因是GBM-TME具有高度的免疫敌意。免疫抑制性GBM-TME的机制是多方面的；影响因素包括肿瘤细胞的突变负荷低、免疫抑制性髓系细胞的高浸润、效应T细胞的缺乏和有效抗原的缺乏。GBM免疫治疗关键的挑战是如何克服高度免疫抑制的TME。

TME中的多种细胞群与免疫抑制的调节和促进脑癌进展有关。例如，研究表明，在GBM中，骨髓来源的巨噬细胞倾向于表现出免疫抑制表型，从而促进肿瘤进展。GBM的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱也显示肿瘤的进展与免疫抑制细胞（如TAMs和MDSCs）的浸润相一致。具有免疫抑制作用的TME也会影响疗效。TME中缺乏细胞毒性T细胞、记忆性T细胞、TH1细胞和其他淋巴细胞浸润，往往导致免疫治疗效果不佳。基于上述发现，近年来的研究尝试将“冷” TME转变为“热” TME作为治疗策略。然而，这些策略仍处于临床前阶段，临床获益不确定。因此，迫切需要寻找更有效的靶点来改善或逆转免疫抑制性GBM-TME。

H19-IRP是一种TAA，具有作为疫苗靶点的潜在价值

H19-IRP在肿瘤细胞中的高度特异性表达，提示H19-IRP可作为肿瘤疫苗的靶点。接下来，研究人员探讨了H19-IRP作为疫苗靶点的可行性。研究人员在GEO数据集中研究了人类和小鼠H19的表达，发现H19仅在人类和小鼠胎盘中高表达，而在其他器官中相对低水平表达，这表明H19在一般人群的体细胞中呈低水平表达。对GBM肿瘤组织和正常组织的免疫印迹也一致表明，H19-Irp在肿瘤组织中特别高表达，而不是其他健康器官组织。研究人员接下来研究了H19-IRP是否可以通过主要组织相容性复合体I类（MHC-I）呈现。研究人员在MES28中进行了人类白细胞抗原(HLA)-I免疫沉淀，然后进行了MS。将质谱结果与H19-IRP序列进行匹配后，研究人员鉴定出了两个来源于H19-IRP的HLA - I结合肽。研究人员接下来研究了H19 - IRP来源的肽是否可以有效地激活CD8+T细胞。H19 - IRP来源的多肽与PBMCs共培养后，外周血T细胞释放大量的IFN-γ。综上所述，这些结果表明H19-IRP在肿瘤中特异性表达，并表现出相当的抗原免疫原性，提示其可能是一个有希望的肿瘤疫苗的靶点。

H19-IRP是一种肿瘤相关抗原，具有作为疫苗靶点的潜在价值

为了制备靶向H19-IRP的环状RNA疫苗，研究人员将H19-ORF线性合成circH19，并将circH19包被脂质纳米颗粒（LNPs），制备环状RNA疫苗（circH19-vac）。荧光素酶活性和H19-Irp水平发生显著变化，表明circH19在体外成功表达。接下来，研究人员通过肌肉注射给小鼠circH19-vac。与空载体组相比，circH19-vac组小鼠表现出更强的发光活性。这些数据表明，circH19-vac在体外和体内都能高效表达H19-IRP抗原。

研究人员将免疫小鼠脾细胞与转染circH19的骨髓来源树突状细胞（BMDCs）共培养24 h，采用IFN-γ酶联免疫斑点法（ELISpot）检测CD8+T细胞的活化情况。circH19疫苗接种小鼠的脾T细胞在体外被转染circH19的BMDCs攻击后释放大量的IFN-γ。为了进一步评估circH19-vac的治疗潜力，研究人员通过疫苗接种策略免疫了携带GL261原位肿瘤的C57BL/6小鼠。CircH19-vac显著降低肿瘤体积，延长生存期。研究人员发现circH19-vac组小鼠的TME发生重塑，M-MDSCs和TAMs减少，CD8+和CD4+T细胞增多，T细胞杀伤能力增强，耗竭程度降低。

为探索靶向人H19-IRP的疫苗的临床应用潜力，研究人员进一步设计了靶向人H19-IRP的疫苗。为了保护这些免疫原性序列并避免潜在的促肿瘤作用，研究人员选择H19-IRP的1 ~ 188个氨基酸序列构建了人circH19 (homo-circH19)，并在其表面涂以LNPs制备了环状RNA疫苗（homo-circH19-vac）。为了评估homo-circH19-vac的治疗效果，研究人员通过疫苗策略免疫了带有MES28原位肿瘤的人源化小鼠模型huHSC-NCG小鼠。与circH19-vac观察到的效果一致，homo-circH19-vac显著缩小了肿瘤体积，延长了小鼠生存期。此外，研究人员观察到homo-circH19-vac组的TME发生重塑，M-MDSCs和TAMs减少，CD8+T细胞和CD4+T细胞增加，T细胞毒性增强，T细胞耗竭水平降低。这些数据表明，利用LncRNA衍生的抗原肽的肿瘤疫苗可能是一种有效的肿瘤免疫治疗策略。

结论

综上所述，研究人员鉴定了一个之前未检测到的蛋白，H19-IRP，它在形成GBM的免疫抑制性TME中起着重要的作用。环状RNA疫苗circH19-vac的制备及其在临床前模型中的疗效强调了本研究的治疗价值。因此，H19-IRP是增强GBM免疫治疗疗效的一个安全且有前景的免疫治疗靶点。