杜小燕教授团队：发现小细胞肺癌治疗新策略

10月31日，首都医科大学杜小燕教授研究团队在期刊《Molecular Cancer》上发表了研究论文，题为“Overcoming multi-drug resistance in SCLC: a synergistic approach with venetoclax and hydroxychloroquine targeting the lncRNA LYPLAL1-DT/BCL2/BECN1 pathway”，本研究中，研究人员发现LYPLAL1-DT在SCLC耐药细胞株中表达上调。功能获得和功能缺失实验表明，LYPLAL1-DT在体外和体内均降低了对cDDP、VP-16或PTX的敏感性。过表达LYPLAL1-DT可促进SCLC细胞自噬，抑制细胞凋亡。进一步的分析，包括RIP和RNA pull-down实验，揭示了LYPLAL1-DT通过吸附miR-204-5p促进BCL2的表达，并与自噬特异性复合物（BECN1/PtdIns3K复合物）的组装有关。在CDX和PDX模型中，venetoclax和HCQ与cDDP、VP-16或PTX联用可有效缓解SCLC细胞的化疗耐药性，并抑制肿瘤生长，且未诱发明显毒性作用。本研究表明维奈托克、羟氯喹联合cDDP、VP-16或PTX的三联疗法可克服难治性SCLC，为对抗SCLC化疗耐药提供了潜在的治疗靶点。

背景信息

小细胞肺癌（SCLC）占所有肺癌的13% ~ 15%，是全球癌症相关死亡率的第六大原因。SCLC具有倍增时间快、增殖能力强、早期广泛转移等特点。尽管诊断和治疗方法不断进步，但SCLC的预后仍然很差，主要原因是各种治疗药物的耐药迅速出现。依托泊苷-铂类仍然是SCLC常用的初始治疗方案。虽然大多数患者起初对化疗有应答，但只有约10%的患者在2年后无病生存，其余患者在一线治疗后会出现复发。甚至紫杉醇等二线治疗也会出现化疗耐药。因此，多药耐药（MDR）已成为SCLC治疗中重要的问题。

SCLC中MDR的发生是一个多方面的过程，涉及遗传、表观遗传和微环境因素的复杂相互作用。凋亡和自噬途径的失调是这一过程的两个关键分子因素。凋亡信号的减少，尤其是抗凋亡系统的激活，使癌细胞逃避化疗，导致细胞失控增殖、肿瘤生存、耐药和癌症复发。B细胞淋巴瘤2 （BCL2）水平的异常升高与多种肿瘤的发生发展及不良预后相关。靶向BCL2失活已成为治疗各种类型癌症有希望的方法之一。小分子BCL2抑制剂ABT-199（商业名称为维奈托克）已在慢性白血病、急性髓系白血病和多发性骨髓瘤中显示出可观的临床疗效。研究人员证明，维奈托克可在体内诱导高表达bcl2的SCLC肿瘤消退，这提示维奈托克有可能用于相当一部分SCLC病例。然而，基于维奈托克的治疗方案也面临耐药的困境。

LYPLAL1-DT通过抑制细胞凋亡降低SCLC细胞的化疗敏感性

研究人员通过Hoechst染色、流式细胞术和caspase 3水平检测细胞凋亡，探讨了LYPLAL1-DT是否参与细胞凋亡的调控。经化疗药物处理后，LYPLAL1-DT过表达组具有典型特征（细胞核凝集）的凋亡细胞比例显著低于对照组，而LYPLAL1-DT敲低组则相反。研究人员通过检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 （caspase 3）的表达，明确化疗后肿瘤细胞的凋亡途径。在cDDP、VP-16和PTX处理下，LYPLAL1-DT过表达细胞的caspase 3活性低于对照组，而LYPLAL1-DT敲低细胞的caspase 3活性高于对照组。流式细胞术证实LYPLAL1-DT过表达可降低H446细胞对化疗药物的敏感性。研究表明LYPLAL1-DT通过抑制线粒体凋亡途径降低SCLC的化疗敏感性。

LYPLAL1-DT通过抑制细胞凋亡降低SCLC细胞的化疗敏感性

LYPLAL1-DT通过直接靶向miR-204-5p上调BCL2表达

之前的研究表明，miR-204-5p是LYPLAL1-DT的调控microRNA之一。通过RIP实验，研究人员证实了LYPLAL1-DT在miR-204-5p/ago2复合物中富集。为了确定LYPLAL1-DT/miR-204-5p轴是否在化疗药物治疗反应中发挥作用，研究人员评估了miR-204-5p在不同条件下的表达水平。在H446/cDDP、H446/VP-16和H446/PTX细胞株中，cDDP、VP-16和PTX处理H446细胞株后，H446细胞株中H446的表达均明显降低，且呈浓度和时间依赖性。同时过表达LYPLAL1-DT和miR-204-5p模拟物较LYPLAL1-DT过表达细胞存活率显著降低，且呈时间依赖性，而miR-204-5p抑制剂增加了IC50值，恢复了LYPLAL1-DT敲低引起的细胞存活率下降。

为了进一步探索miR-204-5p的靶基因，研究人员使用5种生物信息学算法（miRanda、PicTar、TargetScan、miRDB和starBase）预测其潜在的调控靶点。过表达LYPLAL1-DT显著增加BCL2的表达。为了验证miR-204-5p是否靶向BCL2的3 ' -UTR，研究人员构建了包含BCL2 3 ' -UTR （WT）或结合位点突变（MUT）的荧光素酶报告基因。共转染miR-204-5p mimics可显著降低BCL2 WT转染细胞中BCL2的荧光素酶活性，而对MUT BCL2 3 ' -UTR转染细胞中BCL2的荧光素酶活性无明显影响。挽救实验明确LYPLAL1-DT/miR-204-5p/BCL2在SCLC多药耐药中的调控轴。过表达LYPLAL1-DT可显著上调BCL2的表达，而miR-204-5p模拟物可部分恢复上调的BCL2表达。过表达miR-204-5p mimics显著改善LYPLAL1-DT诱导的细胞凋亡抑制。蛋白质免疫印迹实验和qRT-PCR结果显示，BCL2在cDDP、VP-16和ptx耐药细胞株中显著上调。在化疗耐药患者的肿瘤切片中也观察到了类似的结果。而在化疗药物治疗下，其增加呈浓度和时间依赖性。CCK-8结果显示，在cDDP处理下，沉默BCL2后，H446/cDDP细胞的活力和IC50显著降低。综上所述，研究数据证实了LYPLAL1-DT通过抑制miR-204-5p上调BCL2的表达，从而促进SCLC细胞的多药耐药。

结论

综上所述，研究人员发现上调LYPLAL1-DT通过LYPLAL1-DT/miR-204-5p/BCL2轴抑制细胞凋亡，并通过促进PtdIns3K复合体的组装促进自噬，从而介导SCLC的多药耐药。维奈托克、羟氯喹联合cDDP、VP-16或PTX三联疗法可克服难治性SCLC，尤其是在LYPLAL1-DT高表达的患者中。本研究揭示了SCLC化疗耐药的新的分子机制，为临床试验提供了新的治疗方法，为SCLC的治疗提供了一条有希望的道路。